制備YAC DNA進行Southern印跡分析

時間：2021/12/24閱讀：1355

材料與儀器

酵母菌
AHC SCE SCEM Tris·Cl EDTA TE 乙酸甲 RNase A 異丙醇 NaCl
培養(yǎng)箱離心管轉子

步驟

1. 接種一個紅色的含YAC克隆的酵母菌落于盛有20 ml AHC培養(yǎng)基的250 ml 三角燒瓶中，在旋轉搖床上30℃ 250 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。

2. 擴大培養(yǎng)：取1ml 由步驟1獲得的粉紅色菌懸液接種于盛有100 ml AHC培養(yǎng)基的 1 000 ml三角燒瓶中，于30℃ 250 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

3. 將菌懸液移入2個50 ml 的錐形離心管中，于2 000 g 離心5 min，棄上清，共用5 ml SCE緩沖液重懸菌體，并合并到一個試管中。

4. 加1 ml SCEM緩沖液，在旋轉搖床中37℃ 100 r/min 輕搖晃混勻。

5. 于4℃ 2 000 g 離心棄上清，菌體用5 ml Tris/EDTA裂解液重懸。

6. 加0.5 ml 10%SDS顛倒混合數(shù)次，于65℃溫育20 min。

7. 加2 ml 冰浴的5 mol/l pH4.8的乙酸甲緩沖液，顛倒混合數(shù)次后置于冰浴60 min。

8. 于室溫2 000 g 離心10 min，小心將含核酸的上清轉移到一個新管中。加室溫2倍體積的95%乙醇，顛倒混勻。

9. 于室溫2 000 g 離心5 min，棄上清，在室溫晾干10~15 min，分別加入3 ml TE緩沖液，pH8.0于37℃過夜溶解核酸。

10. 加入0.1 ml 的1 mg/ml 無DNA酶活性的RNase A，于37℃溫育1 h。

11. 加入6 ml 室溫的異丙醇，振蕩并顛倒混勻后用一支毛細管纏繞起染色體，然后溶于0.5 ml TE緩沖液中。

12. 加入50 μl 5 mol/l NaCl和2 ml 95%乙醇，顛倒混勻。

13. 再一次纏繞起染色體DNA，并溶于0.5 ml TE緩沖液中，于4℃保存?zhèn)溆谩?/div>

14. 取毎小份2 μg 的YAC DNA和15 μg 用以構建YAC文庫的某物種或個體的基因組DNA。

15. 采用幾種高頻切割的限制性內(nèi)切酶進行酶切，接著用單拷貝探針進行雜交和核酸印跡分析。

16. 一旦通過核酸印跡實驗確證YAC克隆，那么可通過制備染色體凝膠校塊塞和進行脈沖電場凝膠電泳，來明確重組YAC的大小并對其穩(wěn)定性進行初步評價。

同實驗其他方法

YAC 克隆的分析實驗

1. 用接種棒將含重組載體pYAC的AB1380菌株劃線接種在AHC平板上，倒扣平板于30℃培養(yǎng)，直至長出1~3 mm 大小的紅色菌落為止。 2. 短期保存：用Parafilm膜將平

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