牙簽法小量制備質(zhì)粒DNA實驗

時間：2021/12/24閱讀：2033

原理

用牙簽從瓊脂培養(yǎng)基上挑取的菌落可直接用于制備質(zhì)粒 DNA。所得的閉合環(huán)狀 DNA 往往雜質(zhì)太多，不能作為大多數(shù)限制酶的底物。

材料與儀器

抗生素溴酚藍溶液 EDTA 溴化乙錠 NSS 溶液 KCl 瓊脂糖凝膠
LB、YT 或 SOB 熱循環(huán)儀木質(zhì)牙簽

步驟

一、材料

1. 緩沖液和溶液

(1) 用于篩選質(zhì)粒的抗生素

(2) 溴酚藍溶液（0.4%，m/V）或甲酚紅溶液（10 mmol/L）

(3) EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0 )

(4) 溴化乙錠（10 mg/ml ) 或 SYBR Gold

(5) KCl ( 4 mol/L)

(6) NSS 溶液：0.2 mol/L NaOH，0.5% SDS，20% 蔗糖。

2. 凝膠

(1) 瓊脂糖凝膠（0.7%，5 mm 厚），用不含溴化乙錠的 Tris-乙酸鹽或 Tris-乙酸鹽緩沖液配制及電泳。

當質(zhì)粒大小只有很小的差別時，瓊脂糖凝膠電泳應使用 Tris-硼酸鹽電泳緩沖液（TAE），因為它溶解不同大小超螺旋 DNA 的能力更強。否則應使用 Tris-硼酸鹽-EDTA ( TBE）緩沖液，因為它有更強的緩沖能力。

(2) 瓊脂糖凝膠

3. 培養(yǎng)基

(1) LB、YT 或 SOB ( 用于培養(yǎng) E.coli 的高營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基）

(2) LB、YT 或含適當抗生素的 SOB 瓊脂平板

4. 專用設備

(1) 熱循環(huán)儀

(2) 調(diào)至 70℃ 的水浴

(3) 木質(zhì)牙簽

二、方法

1. 細胞的制備

(1) 在含適當抗生素的富養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 ( LB、YT 或 SOB ) 上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了適當質(zhì)粒的菌落，直到它們的直徑長至 2~3 mm ( 對于大多數(shù)菌株，需在 37℃ 下培養(yǎng)約 18 ~24 h )。

(2) 用無菌牙簽或一次性小環(huán)將細菌菌落的一小塊轉(zhuǎn)移到含適當抗生素的一條或一小塊瓊脂母板上，將該菌落的剩余部分轉(zhuǎn)移到已編號的微量離心管中，管內(nèi)含有 50 μl 無菌的 10 mmol/L EDTA ( pH 8.0 )。

除待實菌落外，還應轉(zhuǎn)移幾個“空" 菌落（不含外源基因的質(zhì)粒載體）。這幾個樣品可在凝膠電泳中用做分子質(zhì)量標準參照物。

(3) 重復步驟 2，直到收獲預期數(shù)目的菌落。

(4) 當所有菌落都被復制和轉(zhuǎn)移之后，將母板在 37℃ 培養(yǎng)幾個小時后于 4℃ 保存，直到得到凝膠電泳結(jié)果。然后從母板上收獲其質(zhì)粒為預期大小的菌落。

(5) 在培養(yǎng)母板的時候，對細菌懸液進行以下的處理；在每一微量離心管中順序加入 20 μl 新配置的 NSS 溶液。蓋上管蓋，振蕩混勻 30 s。

(6) 將所有離心管轉(zhuǎn)移到 70℃ 熱水浴中放置 5 min，然后于室溫冷卻。

(7) 在各管中加入 1.5 μl 的 4 mol/L KCl 溶液，振蕩混勻 30 s。

(8) 將離心管在冰上放置 5 min。

(9) 在 4℃ 下以最大速度離心 3 min 以除去細菌碎片。

2. 質(zhì)粒的凝膠電泳分析

(1) 將上清依次轉(zhuǎn)移到潔凈離心管中。如果只用瓊脂糖凝膠電泳分析樣品，在每管中加入 0.4% 的溴酚藍溶液；如果既要用瓊脂糖電泳又要用 PCR 分析，則在樣品中加入 2 μl 10 mmol/L 甲粉紅。在 0.7% 的瓊脂糖凝膠（5 mm 厚）的加樣孔（5 mm 長，2.5 mm 寬）中加 50 μl 上清。

瓊脂糖凝膠不含溴化乙錠，且所用的緩沖液也不含溴化乙錠，因為這樣超螺旋 DNA 的遷移率比插入染料后更準確地反映其分子質(zhì)量。這就能更容易地區(qū)分不同大小的質(zhì)粒。

(2) 當溴酚藍遷移到膠的 2/3 或 3/4 處，或甲酚紅遷移到膠的一半時，室溫下將膠浸在溴化乙錠溶液（0.5 μg/ml 的水溶液）中染色 30~45 min。在紫外燈下觀察凝膠并拍照。

(3) 如果在 (1) 中使用甲酚紅，則宜用 PCR 方法分析上清 ( 用各樣品的剩余液作為模板 )。

甲酚紅（Merk Index 公司）在酸性溶液中是橙色到琥珀色的，pH 為 7.2 時是黃色的，在堿性溶液中是紅色的。與溴酚藍和二甲苯藍不同，甲酚紅不抑制 DNA 聚合酶（Taq 聚合酶，從嗜熱古細菌中提?。┑臒岱€(wěn)定性（Hoppe et al. 1992 )。因而，含甲酚紅的 DNA 溶液在大多數(shù)擴增反應中可用。此染料在 2% 的瓊脂糖凝膠中的遷移位于在二甲苯藍和溴酚藍之間，大小大約相當于 300 bp ( Hoppe et al. 1992 )。在瓊脂糖凝膠電泳照片上，甲酚紅不會產(chǎn)生像溴化乙錠染色一樣的陰影。

(4) 將母板上可能含有重組子的菌落接種到含適當抗生素的 2 ml 液體培養(yǎng)基（LB、YT 或 SOB ) 中，進行小規(guī)模培養(yǎng)。

不需要等到母板上的菌落長到很大。細菌即使只是薄薄的一層，也足夠接種用。

(5) 用此小規(guī)模培養(yǎng)物小量制備待測的重組子質(zhì)粒。用酶切及瓊脂糖電泳分析質(zhì)粒 DNA，以確證其大小和結(jié)構(gòu)與預期一致。

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