SD大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法技巧

SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞簡(jiǎn)單介紹：

       骨髓原始間充質(zhì)干細(xì)胞(SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，是人們?cè)诓溉閯?dòng)物的骨髓基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一種具有分化形成骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)及成肌細(xì)胞的多種分化潛能的細(xì)胞亞群。它們對(duì)骨髓中的造血干細(xì)胞（HSC）不僅有機(jī)械支持作用，還能分泌多種生長(zhǎng)因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）來(lái)支持造血。

　    常用的分離MSC的方法主要有全骨髓法和密度梯度離心法，(SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)全骨髓法即根據(jù)干細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中有貼壁優(yōu)勢(shì)特性，定期換液除去不貼壁細(xì)胞，從而達(dá)到純化及擴(kuò)增MSC的目的。密度梯度離心法即根據(jù)骨髓中各細(xì)胞成分比重的不同，分離單核細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。二者本質(zhì)上無(wú)多大區(qū)別。隨著對(duì)MSC表面抗原認(rèn)識(shí)的深入，又有人利用免疫方法如流式細(xì)胞儀法、免疫磁珠法等對(duì)其進(jìn)行分離純化。但經(jīng)過(guò)流式或磁珠分選后的細(xì)胞出現(xiàn)了增殖緩慢等一些問(wèn)題，加之成本較高和技術(shù)的難度，在某種程度上限制了這些方法的廣泛應(yīng)用。

常見(jiàn)分離方法

密度梯度離心法與流失細(xì)胞儀分離法價(jià)格昂貴且操作復(fù)雜、容易導(dǎo)致細(xì)胞大量流失，應(yīng)用相對(duì)較少。貼壁培養(yǎng)法應(yīng)用最早，具有操作簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞干擾少，不易發(fā)生污染等特點(diǎn)較為廣泛應(yīng)用，其缺點(diǎn)是細(xì)胞純度較低，但有關(guān)研究表明，BMSCs細(xì)胞擴(kuò)增到P1、P2代后細(xì)胞的純度分別可達(dá)到95%、98%。

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞傳代能力測(cè)試

細(xì)胞形態(tài)圖：

細(xì)胞處于快速分裂的狀態(tài)，良好的MSCs顯示較小的紡錘狀的形態(tài)，伴有較多的折光的雙聯(lián)體，為新的正在分裂的細(xì)胞。細(xì)胞首代狀態(tài)較好，多數(shù)呈長(zhǎng)梭形生長(zhǎng)，部分不規(guī)則，極性良好，經(jīng)傳代 5次后，細(xì)胞仍較有活力。以1:2 的分種率傳代，約48h可長(zhǎng)滿。

分化測(cè)試

1. 成脂誘導(dǎo)分化

細(xì)胞匯合度約達(dá) 80%時(shí)，加入間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)液后，細(xì)胞回縮較明顯。11 天后已有大量脂滴出現(xiàn)，培養(yǎng)21天后進(jìn)行油紅O 染色，可見(jiàn)被染為紅色的較標(biāo)準(zhǔn)的脂滴。

油紅O染色試劑盒描述：

     油紅O是一種脂溶性重氮染料，用于染色細(xì)胞和組織中的脂質(zhì)和脂肪沉積物。雖然樣品可能是新鮮的，冷凍的或福爾馬林固定的，但油紅O與石蠟包埋的組織切片不相容。觀察油紅O沉淀是正常的。因此，必須使用Whatman紙或注射器驅(qū)動(dòng)的過(guò)濾器單元通過(guò)過(guò)濾新鮮制備工作溶液。

2.成骨誘導(dǎo)分化

細(xì)胞匯合度約達(dá) 70%時(shí)，加入間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)液，誘導(dǎo) 21 天可見(jiàn)鈣結(jié)質(zhì)，進(jìn)行茜素紅染色鑒定， 茜素紅與類骨質(zhì)結(jié)合，形成同心圓狀的深紅色小結(jié)節(jié)。

茜素紅S染色試劑盒描述：

茜素紅S （Alizarin Red S,簡(jiǎn)稱ARS ）作為一種染料型配位劑在分光光度分析方面已有了廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)，很多作者把 ARS 及其金屬配位物在汞電極上的吸附催化波用于電分析中，提高了測(cè)定的靈敏度和選擇性。

3.成軟骨細(xì)胞分化

細(xì)胞匯合度約達(dá) 70%時(shí)，加入間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo) 21 d 后，使用甲苯胺藍(lán)染色可見(jiàn)較廣泛的細(xì)胞外基質(zhì)藍(lán)紫色，尤其在細(xì)胞堆積區(qū)，圖中為細(xì)胞密度稍低的區(qū)域也可見(jiàn)明顯的異染顆粒。

阿利新藍(lán)染色試劑盒描述：

  阿爾辛藍(lán)是一種用于檢測(cè)細(xì)胞軟骨形成的染料，它可以染色軟骨組織中的硫酸化蛋白多糖。阿爾辛藍(lán)染色試劑盒含有1%的阿爾辛藍(lán)溶液，0.1%的核固紅，方便，即用型溶液。在pH 2.5時(shí)，阿爾辛藍(lán)染色酸性粘多糖并顯示藍(lán)色，而核固紅染色核粉紅色至紅色，細(xì)胞質(zhì)淡粉紅色。

表面分子流式檢測(cè)

CD29:來(lái)源  THermoFisher      PE

CD90:來(lái)源  THermoFisher      PE

CD45:來(lái)源  THermoFisher     FITC

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