ATAC-Seq 實驗操作指南---02 ATAC-Seq 基本操作流程

02 ATAC-seq 基本操作流程

本產(chǎn)品適用于哺乳動物細(xì)胞的染色質(zhì)可及性／開放性研究，針對的細(xì)胞投入量為100-100,000個。

必須具備的材料

1、ATAC-Seq建庫試劑盒

Hyperactive ATAC-Seq Library Prep Kit for Illumina (Vazyme #TD711)

2、建庫接頭

單端96種接頭（每個貨號對應(yīng)24種接頭）：

TruePrep Index Kit V4 for Illumina (Vazyme #TD204/TD205/TD206/TD207)

雙端96種接頭：

TruePrep Index Kit V2 for Illumina (Vazyme #TD202)

雙端384接頭：

TruePrep Index Kit V3 for lllumina (Vazyme #TD203)

3、其他

Qubit 試劑（Vazyme #EQ121）、PCR儀、磁力架、低吸附EP管、PCR管、無水乙醇

注意事項：

6、擴增產(chǎn)物片段分選

推薦使用ATAC DNA Clean Beads對擴增產(chǎn)物進(jìn)行兩步法片段分選，分選方案為0.55x／1.2x。

（1）渦旋振蕩混勻ATAC DNA Clean Beads并吸取33 μl（0.55x）至60μl PCR產(chǎn)物中，渦旋振蕩或使用移液器吹打10次充分混勻，室溫孵育5min。

（2）將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架上，使磁珠與液體分離，待溶液澄清后（約5min）小心轉(zhuǎn)移88μl上清（上清體積＝總體積93-5μl）至新的滅菌PCR管中，丟棄磁珠。

（3）渦旋振蕩混勻ATAC DNA Clean Beads 并吸取72μl（1.2x）至上清中，渦旋振蕩或使用移液器吹打10次充分混勻，室溫孵育5min。

（4）將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架上，使磁珠與液體分離，待溶液澄清后（約5min）小心移除上清。

（5）保持反應(yīng)管始終置于磁力架上，加入200μl新鮮配制的80％乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30sec，小心移除上清。

（6）重復(fù)步驟5，總計漂洗兩次。

（7）保持反應(yīng)管始終置于磁力架上，開蓋空氣干燥約5min。

（8）將反應(yīng)管從磁力架上取出，加入22 μl Nuclease-free ddH2O洗脫。渦旋振蕩或使用移液器吹打10次充分混勻，室溫孵育5min。

（9）將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架上，使磁珠與液體分離，待溶液澄清后（約5min）小心吸取20μl上清至新的滅菌PCR管中，-30～-15℃條件下保存。

7、文庫質(zhì)控

1、用Qubit儀器和對應(yīng)的試劑測文庫濃度

2、安捷倫2100檢測文庫片段分布

測序技術(shù)參數(shù)推薦

1、測序策略：lllumina平臺，MGI平臺，PE 150

2、推薦數(shù)據(jù)量：開放染色質(zhì)區(qū)域的差異鑒定，不低于30M reads／樣本

ATAC-seq 技術(shù)關(guān)鍵

樣本準(zhǔn)備

細(xì)胞活性

建議細(xì)胞活性＞90％，可以使用臺盼藍(lán)染色，進(jìn)行細(xì)胞活力檢測；實驗過程中對細(xì)胞的操作應(yīng)盡量輕柔，以保持細(xì)胞的活性。生長狀態(tài)不佳或死亡的細(xì)胞中，蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合的狀態(tài)會發(fā)生改變，甚至蛋白脫落，變成裸露的DNA，轉(zhuǎn)座子隨機切割可能產(chǎn)生較強的背景噪音，影響實驗結(jié)果。

細(xì)胞投入量與擴增循環(huán)數(shù)

受樣本類型的影響，實驗中可兼容的細(xì)胞投入量并不是固定的，早期實驗建議投入50,000-100,000個細(xì)胞。

文庫產(chǎn)出只要滿足上機需求即可，無需未來獲得更高的文庫產(chǎn)量而設(shè)置過高的擴增循環(huán)數(shù)，循環(huán)數(shù)過多會導(dǎo)致過度擴增、偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴增突變積累等多種不良后果。

特殊樣本流程

特殊樣本流程摘要

特殊樣本的核提取以及操作流程可參考以下文獻(xiàn)

安培生物致力成為推動生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴的合作者

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