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01 ATAC-seq 原理介紹
染色體結(jié)構(gòu)
人類基因組DNA直線長度接近2m,而細(xì)胞的平均直徑一般在幾十微米,要保證DNA的復(fù)制和基因表達(dá)調(diào)控能夠準(zhǔn)確、高效的進(jìn)行,需要將細(xì)胞核中的DNA經(jīng)過多個水平高度有序的包裝。
2個H3-H4二聚體和2個H2A-H2B二聚體形成約11nm的組蛋白八聚體,DNA纏繞其上形成核小體,每個核小體上大約含有146bp的DNA,核小體相互串聯(lián)成為30nm水平纖絲染色質(zhì)。細(xì)胞周期的不同時期,染色質(zhì)濃縮程度不同,在分裂間期,染色質(zhì)相對松散,具有轉(zhuǎn)錄活性的同時DNA暴露區(qū)域也可被特定的核酸酶接近并切割,而在分裂期,染色質(zhì)進(jìn)一步包裝為結(jié)構(gòu)緊密的染色體狀態(tài),此時呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄惰性。
染色質(zhì)可接近性概念
染色質(zhì)分為常染色質(zhì)和異染色質(zhì),在結(jié)構(gòu)上常染色質(zhì)折疊壓縮程度低,處于伸展?fàn)顟B(tài)。DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄時,DNA的致密高級結(jié)構(gòu)變?yōu)樗缮顟B(tài),這部分打開的染色質(zhì),稱之為開放染色質(zhì)(open chromatin)。染色質(zhì)一旦被打開,就允許一些調(diào)控蛋白,比如轉(zhuǎn)錄因子和輔因子與之相結(jié)合,染色質(zhì)的這一特性,就叫做染色質(zhì)可接近性(chromatin accessibility)。這一特性反映了染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄活躍程度。特定條件下的染色質(zhì)開放性變化可以提供大量的基因表達(dá)調(diào)控信息。
Nature Reviews Genetics, 2014, 15(4):272.
圖2:染色質(zhì)的可接近性轉(zhuǎn)換
轉(zhuǎn)錄因子及基因表達(dá)調(diào)控
真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程是大量的順式作用元件與反式作用因子相互作用的結(jié)果,具有調(diào)控功能的反式作用因子通過結(jié)合染色質(zhì)開放區(qū)域調(diào)控真核細(xì)胞基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子識別并結(jié)合起始位點(diǎn)上游序列,如GC Box、CAAT Box和TATA Box等順式作用元件,從而啟動基因的開放表達(dá)。遠(yuǎn)端調(diào)控的增強(qiáng)子,沉默子、絕緣子同樣也可以通過結(jié)合順式作用元件參與調(diào)控基因表達(dá)的開放和關(guān)閉。轉(zhuǎn)錄因子與基因組結(jié)合時,取代了核小體的位置,暴露出DNA,使其對酶的切割更為敏感。在此基礎(chǔ)上,利用染色質(zhì)對DNase的敏感性,鑒定活化的調(diào)控序列。基因表達(dá)調(diào)控是一個動態(tài)平衡的過程,在轉(zhuǎn)錄和翻譯中,染色體三維結(jié)構(gòu)也會處于動態(tài)變化中。
全基因組染色質(zhì)可接近性研究
目前染色質(zhì)可接近性的研究方法主要通過酶解或者化學(xué)方法來分離可接近區(qū)域或者受保護(hù)區(qū)域的DNA序列,然后再經(jīng)過高通量測序分析。轉(zhuǎn)座酶引入高通量測序之前,基因組范圍內(nèi)染色質(zhì)可接近性的研究方法主要包括 MNase-seq,DNase-seq和FAIRE-seq,這些方法可以幫助我們在大量的細(xì)胞系和組織樣本中鑒定出轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄活性開始的位置、核小體和核小體修飾、增強(qiáng)子和絕緣子等。
MNase-seq:微球菌核酸酶(Micrococcal nuclease,MNase)是一種限制性外切酶,進(jìn)行片段化處理時,將DNA切成缺口后,逐個切除寡核苷酸,直到獲得被核小體包裹或者被轉(zhuǎn)錄因子綁定的區(qū)域為止。目前MNase消化法和二代測序聯(lián)合使用,通過定性和定量的方式來識別基因組范圍內(nèi)的平均核小體占據(jù)率、定位以及染色質(zhì)開放區(qū)域。
圖4:MNase-Seq原理圖
DNase-seq:基因活躍表達(dá)時啟動區(qū)域部分序列可能解旋成單鏈,從而不能繼續(xù)纏繞在核小體上,使啟動區(qū)DNA裸露在組蛋白表面,形成對DNaseI的超敏現(xiàn)象。容易被DNase|切割的位點(diǎn)稱為超敏感位點(diǎn)。這些位點(diǎn)是調(diào)控元件如啟動子、增強(qiáng)子、絕緣子和轉(zhuǎn)錄因子等的結(jié)合位點(diǎn)。DNase-seq技術(shù)與MNase-seq技術(shù)互補(bǔ),利用DNase|優(yōu)先切割超敏感位點(diǎn)然后對生成的片段進(jìn)行測序。該方法可用于檢測特定轉(zhuǎn)錄因子等結(jié)合位點(diǎn)。
FAIRE-seq: FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements)甲醛輔助分離調(diào)控元件,是借助有機(jī)溶劑甲醛對染色體中裸露的DNA 進(jìn)行固定,通過細(xì)胞裂解與超聲打斷再進(jìn)行CHCL3抽提獲取水相中的DNA,在CHCL3抽提的過程中,蛋白未交聯(lián)的DNA溶于水相中,而蛋白結(jié)合型的DNA留在兩相界面,實(shí)驗準(zhǔn)備時間3-4天。將FAIRE-seq與ChIP-seq、DNase-seq聯(lián)用可以用于揭示轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、核小體位置分布、染色質(zhì)開放區(qū)域以及三者之間的關(guān)系。
這些研究染色質(zhì)開放區(qū)域、核小體定位、轉(zhuǎn)錄因子占位或者染色質(zhì)生物學(xué)“狀態(tài)"的注釋方法都涉及多個試驗流程,操作復(fù)雜,需要大量細(xì)胞作為研究樣本,并且樣本準(zhǔn)備過程非常繁瑣。
為了解決這些問題,2013年Standford 大學(xué) William Greenleaf 實(shí)驗室的Buenrostro等發(fā)布了一項整合的、多維的遺傳學(xué)分析方法-ATAC-seq,這種方法通過Tn5轉(zhuǎn)座酶將測序的adapters插入到基因組上的“可接近"區(qū)域來標(biāo)記調(diào)控區(qū)域。
ATAC-seq
ATAC-seq 全稱 Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing,是利用轉(zhuǎn)座酶研究染色質(zhì)可接近性的高通量測序技術(shù)。其原理是利用轉(zhuǎn)座酶Tn5可切割開放染色質(zhì)區(qū)域的特性,對Tn5酶捕獲到的DNA序列進(jìn)行測序。DNA轉(zhuǎn)座,是把DNA序列從染色體的一個區(qū)域搬運(yùn)到另外一個區(qū)域的現(xiàn)象,由DNA轉(zhuǎn)座酶來實(shí)現(xiàn)。只要人為地將攜帶已知DNA序列標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座復(fù)合物(即下圖中帶紅/藍(lán)色序列標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座酶Tn5復(fù)合物)與細(xì)胞核一起孵育,再利用帶P5、P7以及index的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可形成文庫,經(jīng)過測序就可以得到開放染色質(zhì)的區(qū)域信息。
ATAC-seq 可低至20個細(xì)胞便能快速的獲取調(diào)控的多維信息,更加適用于珍貴稀少的樣本,且ATAC-seq無片段選擇性,所以這種方法可以同時獲得“開放"染色質(zhì)的位置、轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)、核小體的調(diào)控區(qū)域和染色質(zhì)狀態(tài)等信息。
相對于其他三種染色質(zhì)開放區(qū)域研究,ATAC-seq經(jīng)過一次實(shí)驗,能夠獲得染色體在某個特定時空條件下所有開放染色質(zhì)區(qū)域,并不僅僅局限于某個轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn),或者某個特定的組蛋白乙?;瘏^(qū)域。
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