實時熒光定量PCR應用及結(jié)果分析--相對定量和絕對定量

第三章：實時熒光定量 PCR 的應用

一、相對定量

測定不同樣品中基因表達量的相對值。

內(nèi)參基因的選擇

(1)始終選擇表達充沛、均一的基因做為內(nèi)參基因；

(2)不要盲目選擇常用的內(nèi)參基因；

(3)常用內(nèi)參基因：GAPDH，Actin，Tublin。

內(nèi)參基因的選擇至關重要，決定結(jié)果的有效性

加入內(nèi)參基因后：

結(jié)果計算

二、絕對定量

根據(jù)標準品，測定樣品中基因表達量的絕對值 ( 拷貝數(shù) )。

標準品：具有明確拷貝數(shù)濃度的樣品

A/ 克隆質(zhì)粒 B/ PCR 產(chǎn)物 C/ cDNA ( 擴增效率測定等用途可以使用，絕對定量不能使用 )

拷貝數(shù)計算

平均分子量（MW）:

dsDNA=( 堿基數(shù) ) x (660 道爾頓 / 堿基 )

ssDNA=( 堿基數(shù) ) x (330 道爾頓 / 堿基 )

ssRNA=( 堿基數(shù) ) x (340 道爾頓 / 堿基 )

拷貝數(shù)計算公式 : (6.02 x 1023 拷貝數(shù) / 摩爾 ) x ( 濃度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml

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