促進(jìn)CAR-T轉(zhuǎn)染的材料 —— 生物評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

一個(gè)典型的轉(zhuǎn)染過(guò)程涉及3-4個(gè)步驟：貨物包裝，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞內(nèi)釋放，轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核。貨物的位置很大程度上影響它們是否能夠履行其預(yù)期的功能。例如，對(duì)于基因編輯，貨物必須定位在細(xì)胞核。因?yàn)閷?duì)于長(zhǎng)期穩(wěn)定的基因表達(dá)和基因編輯，貨物必須進(jìn)入細(xì)胞核，并整合入基因組中，因此貨物的定位可視化將會(huì)非常有用。另外，對(duì)于siRNA介導(dǎo)的基因沉默或蛋白瞬時(shí)表達(dá)，藥物必須被遞送進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。熒光共聚焦顯微鏡是最直接的和普遍使用的評(píng)估貨物定位的方法。貨物通常用熒光染料染色，細(xì)胞核用DAPI染色，從而可視化熒光信號(hào)的共定位?？梢酝ㄟ^(guò)一些方法改善貨物在細(xì)胞核的定位，如使用細(xì)胞核定位信號(hào)和微管相關(guān)序列。

在轉(zhuǎn)染過(guò)程中，T細(xì)胞可能會(huì)經(jīng)歷不同程度的擾動(dòng)，進(jìn)而影響它們的關(guān)鍵生理特性，如基因表達(dá)。評(píng)估細(xì)胞擾動(dòng)有以下幾種方式。鈣離子調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞功能，作為第二信使參與多種細(xì)胞通路活動(dòng)。細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子水平通常維持在100*10^-9M，遠(yuǎn)低于在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體及細(xì)胞外環(huán)境的鈣離子水平（兩者分別在µM和mM范圍）。細(xì)胞內(nèi)熒光鈣水平的持續(xù)增加是細(xì)胞壓力的表現(xiàn)，可能會(huì)引起應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路。在轉(zhuǎn)染過(guò)程中，貨物通過(guò)機(jī)械穿孔或電流滲透的方式被引入細(xì)胞。這些過(guò)程在細(xì)胞膜上形成了孔道，鈣離子將會(huì)順著濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的水平的增加和高水平的持續(xù)時(shí)間是膜孔恢復(fù)穩(wěn)態(tài)所需時(shí)間的指標(biāo)。一種定量評(píng)估鈣壓力的方法是使用熒光指示劑，如Fura-2，Indo-1和Fluo-4，并計(jì)算熒光扣除背景熒光之后的變化。另一種觀測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣水平的方法是通過(guò)使用基因編碼的熒光蛋白，如基因編碼的鈣指示劑（GCaMP）。相比化學(xué)指示劑，基因編碼的熒光蛋白不會(huì)造成細(xì)胞毒性，更適合長(zhǎng)期觀測(cè)，但挑戰(zhàn)是質(zhì)粒構(gòu)造必須被優(yōu)化以確保蛋白可以穩(wěn)定表達(dá)。

穩(wěn)健的T細(xì)胞激活是細(xì)胞快速擴(kuò)增的先決條件。T細(xì)胞早期激活標(biāo)志物CD69可用于確定是否該生物特性被轉(zhuǎn)染影響?；罨?，T細(xì)胞分泌一系列的效應(yīng)細(xì)胞因子，如IL-2，TNF-α，IFN-γ（可以通過(guò)ELISA試驗(yàn)檢測(cè)）。另一個(gè)更復(fù)雜的方法，多參數(shù)細(xì)胞因子染色不僅可以用于測(cè)定細(xì)胞因子的產(chǎn)生，還可以測(cè)定特定細(xì)胞亞型的功能標(biāo)記分子。但該實(shí)驗(yàn)方法的缺點(diǎn)是靈敏度低，需要大量的實(shí)驗(yàn)方案優(yōu)化。

抗原特異性的T細(xì)胞可以增強(qiáng)療效和確保安全性。MHC多聚體技術(shù)可以用于測(cè)量修飾后的CAR受體/T細(xì)胞受體（TCR）和遞呈在MHC分子表面的特定腫瘤抗原之間傳導(dǎo)的免疫信號(hào)。這種單細(xì)胞試驗(yàn)使用多種MHC-I或MHC-II分子亞基（二聚體到八聚體）分別驗(yàn)證與表達(dá)CAR的CD8+或CD4+TCR之間的免疫作用。常用的四聚體技術(shù)是將四個(gè)生物素化肽-MHC糖蛋白鏈與鏈酶親和素主鏈連接在一起。

實(shí)體瘤對(duì)于CAR-T療法仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，一個(gè)挑戰(zhàn)是CAR-T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)性差。T細(xì)胞能夠響應(yīng)生物分子遷移，而T細(xì)胞的遷移是一個(gè)非常重要的考量，因?yàn)門(mén)細(xì)胞對(duì)化學(xué)引誘劑的敏感性和遷移能力影響它們的效力，尤其是對(duì)實(shí)體瘤的效力。如果T細(xì)胞可以在實(shí)體瘤里遷移更快更均一，將可能實(shí)現(xiàn)更好的臨床效果。Transwell試驗(yàn)是評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移的常用方法，該方法使用一個(gè)填充了兩種介質(zhì)的小室，一種介質(zhì)是趨化因子如IP-10，另一種是結(jié)合了CXCR3受體的化學(xué)引誘劑，通過(guò)多種膜分開(kāi)兩種介質(zhì)。T細(xì)胞培養(yǎng)在小室上層，一旦感知到趨化因子的化學(xué)梯度，將會(huì)遷移到小室下層。培養(yǎng)一段時(shí)間后，上層小室被移開(kāi)，遷移到膜上的細(xì)胞數(shù)量可以在顯微鏡下通過(guò)血球計(jì)數(shù)確定。膜孔的大小需要謹(jǐn)慎選擇，避免細(xì)胞的非特異性轉(zhuǎn)移。如果使用了熒光標(biāo)記的T細(xì)胞，可以通過(guò)熒光顯微鏡觀察隨時(shí)間變化的遷移行為。