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安捷倫多平臺(tái)解決方案為吐溫降解與抗體制劑中可見異物/不溶性微粒形成機(jī)制研究提供新思路
可見異物/不溶性微粒是注射劑藥物的一項(xiàng)重要質(zhì)控指標(biāo)，各國藥典對(duì)其均有要求。近年來，由于吐溫（聚山梨酯，polysorbate，PS）降解導(dǎo)致抗體制劑中不溶性微粒數(shù)量增加或可見異物產(chǎn)生的問題得到了工業(yè)界和監(jiān)管機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)注。
2021 年 EFPIA（歐洲制藥工業(yè)聯(lián)盟）在 CMC Strategy 論壇期間組織了問卷調(diào)研，其中包括了吐溫降解的問題。針對(duì)抗體藥物液體制劑中吐溫降解最早出現(xiàn)現(xiàn)象的反饋，最多反饋的現(xiàn)象有吐溫含量下降、游離脂肪酸含量上升和不溶性微粒形成等。2022 年國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心賈東晨等在中國新藥雜志“新藥注冊(cè)與技術(shù)審評(píng)”專欄發(fā)表文章，分析了抗體制劑配方中吐溫 20/ 吐溫 80 降解引起可見異物/不溶性微粒的原因，以及對(duì)藥學(xué)研究的思考。
可能的原因分析及控制策略
吐溫是高度異質(zhì)的混合物，容易通過多種途徑發(fā)生降解，如化學(xué)水解、氧化水解和酶水解等。不同降解通路會(huì)產(chǎn)生不同的吐溫降解產(chǎn)物，反之藥物制劑中吐溫降解產(chǎn)物的種類可提示降解通路，從而為吐溫降解機(jī)制的研究提供思路和依據(jù)。酶水解在目前被認(rèn)為是在抗體藥物中吐溫降解的主要原因之一，抗體藥物中通常會(huì)有殘留的 CHO 宿主細(xì)胞蛋白，其中的一些脂肪酶和酯酶能夠水解吐溫結(jié)構(gòu)中的酯鍵部位，生成游離脂肪酸和聚山梨醇。吐溫氧化的降解產(chǎn)物包括過氧化物、醛、酮、脂肪酸酯等，也會(huì)形成少量的游離脂肪酸。游離脂肪酸在制劑條件下溶解度可能會(huì)降低，在低溫時(shí)形成不溶性微粒。
圖 1. 吐溫降解問題決策樹及控制策略
基于吐溫降解以及可見異物/不溶性微粒形成對(duì)抗體制劑穩(wěn)定性的重大影響，安捷倫開發(fā)了基于多技術(shù)平臺(tái)的解決方案，包括吐溫定量、吐溫精細(xì)表征、游離脂肪酸含量分析以及宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留定量分析等，為吐溫的降解途徑研究以及可見異物/不溶性微粒的形成機(jī)制研究提供了新思路。
安捷倫對(duì)于吐溫降解和可見異物/不溶性微粒形成機(jī)制研究的技術(shù)方案
方
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抗體制劑中吐溫定量分析
圖 2. 1290 – ELSD 方法對(duì)抗體制劑中吐溫進(jìn)行定量分析
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吐溫精細(xì)表征與降解通路研究
安捷倫開發(fā)了基于 1290 Infinity II 超高效液相色譜和 6500 系列 QTof 高分辨串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜液質(zhì)聯(lián)用儀，配合 PolymerStudio 軟件和吐溫?cái)?shù)據(jù)庫，支持吐溫精細(xì)表征和降解通路研究。
圖 3. 1290-6500 系列 QTof MS 對(duì)吐溫 20 進(jìn)行精細(xì)表征
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游離脂肪酸含量分析
安捷倫開發(fā)了基于 1290 超高效液相色譜和 MSD iQ 智能化單四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器液質(zhì)聯(lián)用的游離脂肪酸分析方案，能夠?qū)ν聹卦现械挠坞x脂肪酸和抗體制劑中吐溫降解產(chǎn)生的游離脂肪酸分別進(jìn)行定量檢測(cè)。
圖 4. 1290-MSD iQ 對(duì)三種游離脂肪酸（月桂酸、肉豆蔻酸和油酸）分別進(jìn)行定量分析，在 0.01 ug/mL-2.5 ug/mL 范圍內(nèi)線性良好
方
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宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留定量分析
宿主細(xì)胞殘留蛋白（HCP）通常使用 ELISA 方法進(jìn)行定量分析，近年來隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，液質(zhì)聯(lián)用分析 HCP 的方法也得到了廣泛的應(yīng)用。質(zhì)譜法分析 HCP 一般采用自下而上（bottom-up）的方式，將樣品酶切成肽段，再通過分析特征性肽段的方式對(duì) HCP 進(jìn)行定量。
圖 5. 1290 -6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀定量分析 HCP
吐溫降解和可見異物/不溶性微粒形成研究的分析任務(wù)和安捷倫技術(shù)平臺(tái)概覽
參考資料：
1. 賈東晨，何伍?？贵w藥物制劑處方中的可見異物/ 不溶性微粒，《中國新藥雜志》2022 年第31 卷第10 期
2. European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations. Polysorbate degradation and mitigation / control strategy considerations. Presentation from CMC strategy forum Europe 2021.
3. WIVEDI M，BLECH M，PＲESSEＲ I，et al． Polysorbate degradation in biotherapeutic formulations: identification and discussion of current root causes［J］． Int J Pharm，2018，552( 1 － 2) : 422 － 436