細(xì)胞測(cè)試分析系統(tǒng)

細(xì)胞測(cè)試分析系統(tǒng)       流式單細(xì)胞力學(xué)儀

德國(guó)Zellmechanik公司

AcCellerator型

單細(xì)胞力學(xué)流式分析系統(tǒng)

研發(fā)背景

1 研究細(xì)胞力學(xué)在臨床有什么意義？ 如何區(qū)分不同果實(shí)的成熟度？

解決方案：施加適當(dāng)?shù)牧Σ⒏袘?yīng)水果的機(jī)械特性，將清楚地向您展示成熟和過(guò)熟的獼猴桃之間的區(qū)別。

這是否也適用于較小的水果組織碎片？如果我們下降到單細(xì)胞水平怎么辦？

細(xì)胞的機(jī)械特性由功能上重要的細(xì)胞成分控制，例如細(xì)胞骨架。它們構(gòu)成了一種新興的無(wú)標(biāo)記生物標(biāo)志物，可以直接了解細(xì)胞功能或功能障礙。因此，機(jī)械特性有助于理解和評(píng)估藥物治療效果、免疫細(xì)胞活化、干細(xì)胞分化、癌癥預(yù)后或培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)和質(zhì)量的評(píng)估。

   細(xì)胞變形能力與細(xì)胞的狀況和功能相關(guān)。

   無(wú)需標(biāo)記即可評(píng)估細(xì)胞變形能力。

   應(yīng)用潛力巨大。

細(xì)胞力學(xué)構(gòu)成了研究從發(fā)育到疾病的主題的關(guān)鍵科學(xué)目標(biāo)。

2 為什么采用單細(xì)胞流式分析？

Jochen Guck 教授在德累斯頓工業(yè)大學(xué)使用 AFM 和光學(xué)拉伸來(lái)揭示細(xì)胞力學(xué)與細(xì)胞功能（或功能障礙）之間的相關(guān)性。這些方法的一個(gè)主要障礙是低通量（多 100 個(gè)細(xì)胞/小時(shí)）。測(cè)量過(guò)程為：找到一個(gè)細(xì)胞，停止施力，整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后釋放細(xì)胞，分析測(cè)量參數(shù)。為了克服耗時(shí)的步驟，于是他們開(kāi)發(fā)了一種使用具有連續(xù)力和動(dòng)態(tài)分析的連續(xù)流的方法：RT-DC。

Oliver Otto 博士和 Philipp Rosendahl 博士在 2013 年左右實(shí)施了這個(gè)想法。從那時(shí)起，已經(jīng)發(fā)表了許多具有高影響力的科學(xué)論文，并且技術(shù)開(kāi)始普及。

現(xiàn)在可以同時(shí)測(cè)量細(xì)胞的物理特性和熒光信號(hào) (RT-FDC)，從而可以將細(xì)胞的物理特性與細(xì)胞生物學(xué)的黃金標(biāo)準(zhǔn)（熒光流式細(xì)胞術(shù)）進(jìn)行比較和關(guān)聯(lián)。近還可以沿通道動(dòng)態(tài)跟蹤細(xì)胞變形并研究變形的時(shí)間相關(guān)動(dòng)力學(xué) (dRT-DC)。

技術(shù)原理

1 如何高速的壓縮單個(gè)細(xì)胞？

為了產(chǎn)生確定的力，孤立的細(xì)胞被泵送通過(guò)橫截面略大于細(xì)胞橫截面的微通道。周圍流體的壓力梯度產(chǎn)生流動(dòng)剖面并使細(xì)胞流體動(dòng)力學(xué)變形。流體的流速和粘度控制作用在細(xì)胞上的力。

細(xì)胞可以通過(guò)流體動(dòng)力變形。

力由流速和粘度控制。

較軟的細(xì)胞顯示較大的變形。

RT-DC 中的“實(shí)時(shí)"來(lái)自于拍攝圖像時(shí)對(duì)細(xì)胞輪廓的即時(shí)分析。

細(xì)胞面積、高度、寬度、縱橫比等的立即計(jì)算允許對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行即時(shí)觀察和選通。

該算法還計(jì)算細(xì)胞的亮度和亮度偏差等參數(shù)，從而深入了解形態(tài)學(xué)特性。

系統(tǒng)保存每個(gè)檢測(cè)到的事件圖像，可以輕松查看異常值是碎片還是您正在尋找的稀有細(xì)胞。

3 如何表征力進(jìn)而計(jì)算楊氏模量？

以下未發(fā)布素材

肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維組織促進(jìn)浸潤(rùn)前乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞硬化和增殖

乳腺癌是女性死亡的主要原因。乳腺癌進(jìn)展的多步驟過(guò)程源于癌基因和腫瘤抑制基因的遺傳和表觀遺傳改變，這些改變賦予乳腺細(xì)胞生長(zhǎng)和/或生存優(yōu)勢(shì)。隨后的分子改變可能會(huì)將這些癌前細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞，具有侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

病毒非受體酪氨酸激酶 v-Src 及其細(xì)胞同源物 c-Src 是研究多的原癌基因，涉及腫瘤發(fā)展的許多方面，包括增殖、存活、粘附、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。Src 蛋白水平，在更大程度上，Src 蛋白激酶活性在惡性和非惡性乳腺組織中經(jīng)常升高，并且與乳腺癌患者的存活率降低顯著相關(guān)。

Src 主要通過(guò)降低粘附性和調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架3來(lái)誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移。由單體肌動(dòng)蛋白亞基 (G-actin) 組裝而成的絲狀肌動(dòng)蛋白 (F-actin) 的半柔性聚合物施加或抵抗力以驅(qū)動(dòng)大量細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞形狀、細(xì)胞移動(dòng)性、胞質(zhì)分裂的變化和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。此外，肌動(dòng)蛋白絲將外力轉(zhuǎn)化為指導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的生化信號(hào)事件。這主要在腫瘤侵襲和惡性腫瘤的背景下進(jìn)行了研究，其中來(lái)自腫瘤微環(huán)境的機(jī)械信號(hào)會(huì)影響轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián). 反過(guò)來(lái)，轉(zhuǎn)移性乳腺細(xì)胞的硬度低于健康細(xì)胞，這在很大程度上取決于細(xì)胞骨架。為了執(zhí)行這些不同的功能，肌動(dòng)蛋白絲通過(guò)控制在物種之間高度保守的大量肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白 (ABP) 組織成不同的結(jié)構(gòu). Ena/VASP（啟用/血管擴(kuò)張劑刺激的磷蛋白）家族蛋白，包括蛋白質(zhì)啟用的同源物 (Mena)、血管擴(kuò)張劑刺激的磷蛋白 (VASP) 和 Ena-VASP 樣 (EVL)，與肌動(dòng)蛋白絲的倒刺末端相關(guān)。它們似乎對(duì) F-肌動(dòng)蛋白有不同的影響，包括通過(guò)其抗加帽活性促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲伸長(zhǎng)、抑制分支肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的形成和促進(jìn) F-肌動(dòng)蛋白捆綁。因此，Ena/VASP 家族成員對(duì)癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移具有不同的影響。雖然 EVL 抑制細(xì)胞遷移，但 Mena 變體 Mena (INV) 驅(qū)動(dòng)侵襲、血管內(nèi)滲透和轉(zhuǎn)移. 其他 ABP 抑制肌動(dòng)蛋白聚合或穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白絲。此外，一些 ABP 將肌動(dòng)蛋白絲組織成更高階的網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)交聯(lián)肌動(dòng)蛋白絲，或使用 F-肌動(dòng)蛋白作為支架、物理支撐或軌道，以促進(jìn)收縮性并產(chǎn)生張力。

我們以前曾報(bào)道過(guò) Src 的促生長(zhǎng)功能是由果蠅上皮細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架控制的。在本報(bào)告中，我們研究了 F-肌動(dòng)蛋白在支持 Src 下游癌癥前體擴(kuò)張中的作用。使用具有條件 Src 誘導(dǎo)的乳腺細(xì)胞系，我們證明在細(xì)胞獲得惡性特征之前，它們會(huì)經(jīng)歷短暫的應(yīng)力纖維依賴性硬化狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和向*轉(zhuǎn)化狀態(tài)的進(jìn)展。

骨髓生態(tài)位模擬物通過(guò)整合素信號(hào)調(diào)節(jié) HSPC 功能

造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞 (HSPC) 錨定在骨髓 (BM) 中稱為造血生態(tài)位的特殊微環(huán)境中。這些細(xì)胞由它們的自我更新能力和產(chǎn)生所有成熟血細(xì)胞的能力來(lái)定義。在臨床或組織工程使用之前，人類 HSPCs 可以通過(guò)表面抗原 CD34 進(jìn)行富集。由于這些細(xì)胞在大多數(shù)移植來(lái)源中占少數(shù)，并且適用細(xì)胞的數(shù)量有限，因此已使用細(xì)胞因子雞尾酒或小分子建立離體擴(kuò)增培養(yǎng)物. 然而， HSPCs 在懸浮液中的體外培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致異質(zhì)細(xì)胞群具有未定義的細(xì)胞身份。

在 BM 生態(tài)位中，HSPCs 不僅由細(xì)胞因子維持，而且由細(xì)胞-基質(zhì)粘附初步維持，通過(guò)粘附受體介導(dǎo)，例如整合素 (ITG)。在這方面，發(fā)現(xiàn) β1 (CD29) 和 β2 ITGs 促進(jìn) HSPCs 與間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞 (MSCs) 的初始接觸并且 β3 (CD61) 表達(dá)被證明是體內(nèi) 長(zhǎng)期再增殖 HSPCs 的標(biāo)志物. 因此，使用 HSPC 和 MSC 等生態(tài)位細(xì)胞的共培養(yǎng)離體重塑 BM 生態(tài)位逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，并被證明是干細(xì)胞擴(kuò)增的有前途的工具. 然而，在臨床或研究應(yīng)用中，兩個(gè)細(xì)胞群的直接接觸需要 HSPC 培養(yǎng)后純化。

為了解決這些問(wèn)題，我們使用了一種在體外重塑BM細(xì)胞外基質(zhì)的新型培養(yǎng)方法，即從永生化間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（SCP-1）衍生的脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）支架。這種支架被發(fā)現(xiàn)具有高度可重復(fù)性，并提供超過(guò) 500 種蛋白質(zhì)，包括主要的生態(tài)位蛋白，如膠原蛋白、纖連蛋白、糖胺聚糖以及骨橋蛋白和信號(hào)分子，如基質(zhì)衍生因子 1 (SDF-1)。因此，提供了存在于BM壁龕中的粘合面和物理提示。發(fā)現(xiàn)周圍環(huán)境的生物力學(xué)力通過(guò)整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞，并在體外被證明可以控制 HSPC 的命運(yùn)。 _ _ _ _ 這些物理方面被證明是分化的標(biāo)志并驅(qū)動(dòng)細(xì)胞命運(yùn)決定。然而，HSPC 與 BM 基質(zhì)相互作用的詳細(xì)機(jī)制僅關(guān)于細(xì)胞外環(huán)境的了解較少。

通過(guò)培養(yǎng)從粒細(xì)胞集落刺激因子 (G-CSF) 動(dòng)員的健康供體的外周血 (PB) 中分離的人 CD34 +細(xì)胞，在去細(xì)胞 ECM 制劑上使用低濃度的細(xì)胞因子，我們可以分離兩種細(xì)胞部分：貼壁 (AT) 和上清液。 SN) 細(xì)胞，類似于與 MSC 的 HSPC 共培養(yǎng)物。使用實(shí)時(shí)變形細(xì)胞儀 (RT-DC)為了揭示塑料培養(yǎng)皿 (PCD) 中新鮮分離的 SN、AT 和經(jīng)典懸浮培養(yǎng)的 HSPCs 的生物力學(xué)表型，我們發(fā)現(xiàn)新鮮分離的細(xì)胞與培養(yǎng)細(xì)胞相比是同質(zhì)的可變形細(xì)胞和小細(xì)胞。與 PCD 培養(yǎng)或 SN 細(xì)胞相比，AT 細(xì)胞顯示肌動(dòng)蛋白聚合到應(yīng)力纖維、強(qiáng)烈的遷移行為和不易變形的表型。發(fā)現(xiàn) SDF-1 通過(guò) CXC 趨化因子受體 4 型 (CXCR4) 被 AT 細(xì)胞主動(dòng)識(shí)別和內(nèi)化。此外，CXCR4 被認(rèn)為在 AT 細(xì)胞中偏向 ECM 蛋白。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)在 AT 細(xì)胞上誘導(dǎo) ITGαIIb、ITGαV 和 ITGβ3 的表面表達(dá)，并且可以證實(shí) ITGαvβ3 在 HSPC-ECM 相互作用中在粘附和遷移方面的重要作用。