介紹

關(guān)節(jié)炎的患病率和費(fèi)用占年度醫(yī)療保健費(fèi)用的 10% 以上。本研究旨在比較 3D 打印、生物打印及其組合在形狀保真度和生物力學(xué)方面的技術(shù)。

方法

從根據(jù) IACUC 批準(zhǔn)的方案死亡的兔子 (n = 3；7-9 個(gè)月) 的膝蓋中分離軟骨細(xì)胞。在冷凍保存（95% 胎牛血清，5% 二甲基亞砜）之前，使用透明質(zhì)酸酶（30 分鐘）和膠原酶（8 小時(shí)）解剖、切碎和消化軟骨。將軟骨細(xì)胞解凍并接種到失活的豬滑膜細(xì)胞基質(zhì)包被的燒瓶中（~6000 個(gè)細(xì)胞/cm2）。在 90% 匯合時(shí)，將細(xì)胞胰蛋白酶化（0.25% 胰蛋白酶/EDTA；Hyclone）并分成 8 組：1）無支架片，2）無支架圓頂，3）直寫聚己內(nèi)酯支架片，4）直接寫聚己內(nèi)酯支架圓頂，5) 膠原蛋白封裝（LifeInk200，Advanced Biomatrix）片材，6) 膠原蛋白封裝（LifeInk200，Advanced Biomatrix）圓頂，7) 膠原蛋白封裝（LifeInk200，Advanced Biomatrix) 聚己內(nèi)酯支架上的片材，8) 膠原蛋白封裝（LifeInk200，Advanced Biomatrix）圓頂在直接寫入的聚己內(nèi)酯支架上。凸圓頂模具在丙烯腈丁二烯苯乙烯（ABS，Hictop iprusa）中進(jìn)行 3D 打印，然后通過在漂白劑中孵育、在硫代硫酸鈉中中和并在無菌水中沖洗，然后在層流柜中干燥。直接寫入支架是在聚己內(nèi)酯 (RegenHu) 中依次用較小、然后較大的網(wǎng)格（70、60、50、40、30、40、50、60、70 µm）生產(chǎn)的；圓頂是通過在 55°C 下在 ABS 圓頂上孵育產(chǎn)生的。使用重新懸浮在 DMEM/F12 + 10% FBS 中的軟骨細(xì)胞與膠原蛋白 1:5 混合（LifeInk200 Advanced Biomatrix，Se3d Reb3l 注射器擠出生物打印機(jī)）進(jìn)行生物打印。將構(gòu)建體在 30 ml Nalgene 容器中孵育，該容器用 0.2 µm 無菌的注射器過濾器進(jìn)行了氣體交換（圖 1A；5% CO2、5% O2、90% N2）。第 1-4 組立即在軟骨形成培養(yǎng)基 [1] 中孵育，而生物打印構(gòu)建體（第 5-8 組）在軟骨形成培養(yǎng)前在補(bǔ)充有 10% FBS 的 DMEM/F12 中孵育 24 小時(shí)，因?yàn)橹暗膶?shí)驗(yàn)確定在軟骨形成培養(yǎng)基導(dǎo)致軟骨細(xì)胞活力極低。將所有構(gòu)建體置于第 2 天 10 rpm 和第 5 天 60 rpm 的旋轉(zhuǎn)振蕩器上。將構(gòu)建體培養(yǎng) 28 天，每 2-3 天更換一次軟骨培養(yǎng)基。在收獲時(shí)，在干冰上冷凍之前，視覺和觸覺評估評分為 1-5（5=佳）。機(jī)械測試：樣品在室溫下在 PBS 中解凍。然后，每個(gè)圓頂樣品都固定在球形不銹鋼層上。相機(jī)配準(zhǔn)（Mapping Toolbox，Biomomentum Inc，Canada）用于疊加位置網(wǎng)格（每個(gè)樣本約 20-30 個(gè)位置）。使用允許使用多軸機(jī)械測試儀（Mach-1v500css，Biomomentum Inc，加拿大；垂直軸上的 17N 范圍和 0.85mN 分辨率，水平軸上的 12N 范圍和 0.60mN 分辨率軸）。使用垂直于表面移動的球形壓頭（D = 0.50 mm）獲得垂直壓痕。軟骨以 100 µm/s 的速度縮進(jìn) 100 µm，并允許 60 秒的松弛時(shí)間。之后，將球形壓頭替換為針式探針，在同一網(wǎng)格的每個(gè)位置進(jìn)行自動厚度映射。分析：根據(jù)自動厚度映射結(jié)果，通過表面的垂直位置（載荷開始增加的位置）與軟骨/骨界面的垂直位置（對應(yīng)于個(gè)拐點(diǎn)）之間的差異計(jì)算每個(gè)位置的軟骨厚度。位移/力曲線）。每個(gè)位置的瞬時(shí)模量是通過將載荷-位移曲線（相應(yīng)的厚度和有效泊松比為 0.5）擬合到壓痕中的彈性模型獲得的 [2]。使用帶有 Dunnetts Post-Hoc 分析的 ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過表面的垂直位置（負(fù)載開始增加的位置）與軟骨/骨界面的垂直位置（對應(yīng)于位移/力曲線中的個(gè)拐點(diǎn)）之間的差異計(jì)算每個(gè)位置的軟骨厚度。每個(gè)位置的瞬時(shí)模量是通過將載荷-位移曲線（相應(yīng)的厚度和有效泊松比為 0.5）擬合到壓痕中的彈性模型獲得的 [2]。使用帶有 Dunnetts Post-Hoc 分析的 ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過表面的垂直位置（負(fù)載開始增加的位置）與軟骨/骨界面的垂直位置（對應(yīng)于位移/力曲線中的個(gè)拐點(diǎn)）之間的差異計(jì)算每個(gè)位置的軟骨厚度。每個(gè)位置的瞬時(shí)模量是通過將載荷-位移曲線（相應(yīng)的厚度