注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

吲哚乙酸（IAA）在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破壞失去活性。植物體內(nèi)吲哚乙酸氧化酶活力的大小，對(duì)調(diào)節(jié)體內(nèi)吲哚乙酸的水平，起著重要的作用，而影響植物的生長(zhǎng)。

測(cè)定原理：
在無(wú)機(jī)酸存在情況下，吲哚乙酸能與FeCl3作用，生成紅色螯合物，該物質(zhì)在530nm處有最大吸收峰，酶活力的大小可以其破壞吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法測(cè)定。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、1.5mL離心管、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體10mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體10mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：液體10mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑六：液體50mL×1瓶，4℃保存。臨用前吸取1mL試劑五加入試劑六中混勻，待用，避光保存

粗酶液提?。?/span>

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.        血清等液體：直接測(cè)定。

測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到530 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二、試劑三、試劑四置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中保溫20min。

3. 取1.5mL EP管若干，按操作依次加入試劑，操作表如下：

注意：標(biāo)準(zhǔn)管只需做一次

IAA氧化酶活性計(jì)算公式：

a.        使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y = 1.334x + 0.025  R² = 0.998 （x為IAA濃度，mmol /L；y為吸光值）

（1）         按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：從開始時(shí)加入的IAA量減去酶作用后殘留的IAA含量，即得被酶所催化的IAA含量。以每mg酶蛋白在1h內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

 U（μmol/h/mg prot）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V樣÷（V樣×Cpr）÷T

=1.5×（A1-A2）÷Cpr

（2）         按樣本鮮重計(jì)算

酶活定義：以每g樣本在1h內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U（μmol/h/g 鮮重）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V樣÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

=1.5×（A1-A2）÷W

（3）         按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：以每1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞在1h內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U（μmol/h/10⁴ cell）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V樣÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

=1.5×（A1-A2）÷細(xì)胞數(shù)量

（4）         按液體體積計(jì)算

酶活定義：以每mL酶液在1h內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U（μmol/h/mL）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V樣÷(V樣÷V樣總) ÷T

=1.5×（A1-A2）

V樣總：上清液總體積，1mL；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g，T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y = 0.667x + 0.025  R² = 0.998 （x為IAA濃度，mmol /L；y為吸光值）

（1）按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：從開始時(shí)加入的IAA量減去酶作用后殘留的IAA含量，即得被酶所催化的IAA含量。以每mg酶蛋白在1h內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

 U（μmol/h/mg prot）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V樣÷（V樣×Cpr）÷T

=3×（A1-A2）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

酶活定義：以每g樣本在1h內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U（μmol/h/g 鮮重）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V樣÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

=3×（A1-A2）÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：以每1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞在1h內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U（μmol/h/10⁴ cell）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V樣÷(V樣÷V樣總×W) ÷T

=3×（A1-A2）÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

酶活定義：以每mL酶液在1h內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U（μmol/h/mL）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V樣÷(V樣÷V樣總) ÷T

=3×（A1-A2）

V樣總：上清液總體積，1mL；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g，T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h。

注意事項(xiàng)：

Z低檢出限為0.01μmol/mL。

提供商	優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司	下載次數(shù)	8次
資料大小	41.5KB	資料類型	WORD 文檔 免費(fèi)下載該資料
資料圖片	點(diǎn)擊查看	瀏覽次數(shù)	978次