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新品推薦|多聚半乳糖醛酸酶(PG)試劑盒

閱讀:2321      發(fā)布時間:2023-4-3
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關(guān)于新品推薦|多聚半乳糖醛酸酶(PG)試劑盒說明書

  微量法100T/48S

   意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

多聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)是一種細(xì)胞壁結(jié)合蛋白,可以催化果膠分子中α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解,參與果膠的降解,使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體,導(dǎo)致果實軟化,與果實成熟、葉和花的脫落、病原物防御,細(xì)胞伸展發(fā)育以及木質(zhì)化有關(guān),在植物抗病性和食品貯藏保鮮領(lǐng)域具有較高的研究價值。

測定原理:

多聚半乳糖醛酸酶水解果膠酸生成半乳糖醛酸,具有還原性醛基,與DNS試劑反應(yīng)生成紅棕色物質(zhì),在540nm有特征吸收峰,測定540nm處吸光值變化可計算得多聚半乳糖醛酸酶活性。

自備實驗用品及儀器:

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體8mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體15mL×1瓶,4℃避光保存。

酶液提?。?/span>

1.組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。16000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2.細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后16000g,4℃離心10min,取上清置于冰上待測。

3.培養(yǎng)液:直接檢測。

測定操作表:


對照管

測定管

樣本(μL


30

煮沸樣本(μL

30


試劑一(μL


120

蒸餾水

120


40℃水浴30min

試劑二(μL

150

150

沸水浴5min,冰浴或自來水冷卻,取200μL于微量石英比色皿/96孔板測定540nm處吸光值A,△A=A測定管-A對照管。每個測定管設(shè)一個對照管。

酶活性計算公式

a.        用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 3.9642x - 0.008;R2 = 0.9996x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,mg/mL;y為吸光值。

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義:40℃,pH6.0條件下,每毫克蛋白每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

PG活性(mg/h/mg prot= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷V×Cpr÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義:40℃,pH6.0條件下,每克樣本每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

PG活性(mg/h/g 鮮重)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷V×W÷V樣總)÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

3.按液體體積計算

酶活性定義:40℃,pH6.0條件下,每毫升培養(yǎng)液每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

PG活性(mg/h/mL=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷V÷T=2.523×(ΔA+0.008)

4. 按細(xì)胞數(shù)量計算

酶活性定義:40℃,pH6.0條件下,每104個細(xì)胞每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

PG活性(mg/h/104cell=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷V×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷細(xì)胞數(shù)量    

V反總:反應(yīng)總體積,0.15mL;V樣:反應(yīng)中樣本體積,0.03mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W,樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時間,0.5h

 

b.       96孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 1.9821x - 0.008,R2 = 0.9996x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,mg/mL;y為吸光值。

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義:40℃,pH6.0條件下,每毫克蛋白每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

PG活性(mg/h/mg prot=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷V×Cpr÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義:40℃,pH6.0條件下,每克樣本每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位(U)。

PG活性(mg/h/g 鮮重)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷V×W÷V樣總)÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷W

3.按液體體積計算

酶活性定義:40℃,pH6.0條件下,每毫升培養(yǎng)液每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位(U)。

PG活性(mg/h/mL=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷V÷T=5.045×(ΔA+0.008)

4. 按細(xì)胞數(shù)量計算

酶活性定義:40℃pH6.0條件下,每104個細(xì)胞每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位(U)。

PG活性(mg/h/104cell=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷V×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷細(xì)胞數(shù)量

V反總:反應(yīng)總體積,0.15mLV樣:反應(yīng)中樣本體積,0.03mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W,樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時間,0.5h

注意事項:

煮沸樣本建議將樣本在沸水中煮沸10分鐘,以將酶徹di滅活。


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