脂蛋白酯酶（Lipoprotein lipase，LPL）試劑盒說明書

微量法100T/48S

注      意  ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

脂蛋白酯酶是脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、乳腺細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成的一種酶，可催化甘油三脂水解為脂肪酸和單酸甘油酯，以供組織氧化供能和貯存，并在不同的組織表現(xiàn)出不同的生理意義。

測(cè)定原理：

脂蛋白酯酶水解4-硝基苯棕櫚酸酯產(chǎn)生4-硝基苯酚，在400nm有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、冷凍離心機(jī)、研缽、水浴鍋、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板。

試劑組成和配制 ：

試劑一：液體105mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體4mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體10mL×1瓶，4℃保存。

樣品處理：

1.        組織：按照質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清待測(cè)。

2.        細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后于4℃，10000g離心10min，取上清待測(cè)。

3.        血清：直接測(cè)定。

測(cè)定操作：

計(jì)算公式：

a.        用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y= 0.0581x -0.0169，R²=0.9982

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在45℃，pH7.5條件下，每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

LPL活性（μmol /min/mg prot）= （△A+0.0169）÷ 0.0581×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 17.21×（△A+0.0169）÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在45℃，pH7.5條件下，每克組織每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

LPL活性（μmol /min/g 鮮重）=（△A+0.0169）÷0.0581×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

= 17.21×（△A+0.0169）÷W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在45℃，pH7.5條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

LPL活性（μmol /min/10⁴ cell）= （△A+0.0169）÷0.0581×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T

                                        = 17.21×（△A+0.0169）÷細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：在45℃，pH7.5條件下，每毫升血清每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

LPL活性（μmol /min/mL）=（△A+0.0169）÷0.0581×V反總÷V樣÷T

                                 = 17.21×（△A+0.0169）

V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.02mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min

b．用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y= 0.029x -0.0169，R²=0.9982

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在45℃，pH7.5條件下，每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

LPL活性（μmol /min/mg prot）= （△A+0.0169）÷ 0.029×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 34.42×（△A+0.0169）÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在45℃，pH7.5條件下，每克組織每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

LPL活性（μmol /min/g 鮮重）=（△A+0.0169）÷0.029×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

= 34.42×（△A+0.0169）÷W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在45℃，pH7.5條件下，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

LPL活性（μmol /min/10⁴ cell）= （△A+0.0169）÷0.029×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T

                                        =34.42×（△A+0.0169）÷細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：在45℃，pH7.5條件下，每毫升血清每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。

LPL活性（μmol /min/mL）=（△A+0.0169）÷0.029×V反總÷V樣÷T

                                 = 34.42×（△A+0.0169）

V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.02mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min

注意事項(xiàng)：

1.        試劑三加入混勻后靜置兩分鐘立即測(cè)定，否則影響吸光值。

2.        吸光值過高或者測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定，則將酶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專⒃谟?jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

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