快速實時PCR支原體檢測在制藥行業(yè)中的應(yīng)用

       支原體又稱霉形體，直徑在0.1-0.3μm，是目前發(fā)現(xiàn)的小的原核生物，可以輕松地通過濾膜，混入培養(yǎng)系統(tǒng)中，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分支狀等多種形態(tài)。通常依附在細(xì)胞膜表面，支原體沒有剛性的細(xì)胞壁，因此普通的抗生素對它根本不起作用，實驗室常見的種類有：口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、發(fā)酵支原體、人型支原體、唾液支原體、肺支原體和梨支原體等。

       生物制藥產(chǎn)品（也被稱為生物制品或大分子藥物）的支原體污染是由生產(chǎn)過程中的細(xì)胞培養(yǎng)污染引起的，會給患者帶來潛在的健康風(fēng)險。支原體幾乎能夠影響細(xì)胞培養(yǎng)的每一個參數(shù)，并且通常僅產(chǎn)生微小的可見變化，對于制藥產(chǎn)業(yè)來說，它們是一種無法掌控的、可造成潛在損害的因素。因此，監(jiān)管部門要求制造商檢測自己生產(chǎn)的生物制品，確保被放行出廠的產(chǎn)品中都不含支原體。

      生物制藥產(chǎn)品（也被稱為生物制品）是生產(chǎn)和提取自細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞系或哺乳動物等生物來源的醫(yī)藥產(chǎn)品。疫苗、血液成分、重組蛋白、基因治療、組織以及用于治療的細(xì)胞都屬于這個類別。它們含有核酸、蛋白、糖以及由這些物質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合物，與人體內(nèi)天然存在的分子*相同或者具有相似性。與化學(xué)合成藥物（通常指的是小分子）不同，生物制品的分子量要大得多，通常是小分子藥物的 100 倍以上。用哺乳動物細(xì)胞系進(jìn)行生物制藥生產(chǎn)通常使用基因工程技術(shù)開發(fā)出表達(dá)生物大分子的真核細(xì)胞系（如CHO 或HEK293），然后進(jìn)行收獲、純化和制劑。

       由于生產(chǎn)流程十分復(fù)雜，所以生物制藥產(chǎn)品的生產(chǎn)和產(chǎn)品放行都面臨著*的挑戰(zhàn)。首先，細(xì)胞系可能會被支原體污染，因此批放行之前需要先進(jìn)行支原體檢測。其次，由于生物制品采用過濾法除菌，所以存在支原體或病毒穿過濾膜的潛在風(fēng)險。第三，污染物可能會通過原料進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)物。正因為如此，支原體檢測尤其是早期報警系統(tǒng)（也稱為過程控制）是十分必要的質(zhì)量控制技術(shù)，以期盡快盡早地發(fā)現(xiàn)污染物。

      在生物制藥行業(yè)，支原體污染產(chǎn)生的影響幾乎具有毀滅性，例如整批產(chǎn)物都必須丟棄，生產(chǎn)車間也必須停產(chǎn)整頓 14。國際監(jiān)管機(jī)構(gòu)發(fā)布的指南已經(jīng)闡明，為了確保產(chǎn)品的安全性、純度和產(chǎn)品效力，生物制藥產(chǎn)品中不能存在支原體污染。因此，為了確保整個生產(chǎn)流程的平穩(wěn)，必須盡早實施支原體檢測。

     支原體檢測方法有兩種經(jīng)典的方法被用于常規(guī)支原體檢測，它們的靈敏度和可靠性已經(jīng)獲得了證實：（i）培養(yǎng)法（也被稱為瓊脂肉湯法），（ii）指示細(xì)胞培養(yǎng)法。有些基于酶或免疫學(xué)的非藥典分析法具有速度快和容易實施的優(yōu)點(diǎn)，但它們的靈敏度都不如培養(yǎng)法。因此，藥典專論認(rèn)為這些檢測方法不能替代常規(guī)檢測。在過去幾年里，對速度快、靈敏度高且穩(wěn)健性高的支原體檢測法的需求迫切性日益增加，因為經(jīng)典培養(yǎng)法的所需時間過長，可能會耽擱產(chǎn)品的放行，并由此產(chǎn)生高昂的費(fèi)用。EP 指南指出，如果 PCR 檢測方案的靈敏度能達(dá)到與經(jīng)典培養(yǎng)法相同的水平，并且具有良好的穩(wěn)健性和特異性，則可以用 PCR作為支原體檢測方案替代經(jīng)典培養(yǎng)法。

     實時 PCR（qPCR）能夠?qū)崟r報告 DNA 的擴(kuò)增情況。因此，實時 PCR 不需要在 PCR 處理后用凝膠電泳等方法檢測 DNA，大幅降低了在實驗室里發(fā)生污染的風(fēng)險，并且有助于對終結(jié)果進(jìn)行解釋。實時 PCR 使用的探針含有與短 DNA 序列（18 - 30 個堿基對）相連接的熒光染料。這種探針在 PCR 的每個擴(kuò)增循環(huán)中都會被納入新合成的 DNA 互補(bǔ)鏈。市場上有多種不同的探針設(shè)計可供選擇，其中常見的探針之一就是 MycoTOOL qPCR 使用的水解探針。在每個 PCR 循環(huán)結(jié)束后，這種探針都會以熒光強(qiáng)度的形式報告 DNA 的總量。隨著目標(biāo)序列的不斷擴(kuò)增，熒光信號的強(qiáng)度也會成比例地升高。將熒光強(qiáng)度與 PCR 循環(huán)數(shù)對應(yīng)作圖，就可以得到一條典型的 S狀 qPCR 曲線。

    雖然很多國家的藥典都將 PCR描述為一種有效的支原體檢測方法，但各國為這種方法制定的方案或驗證要求卻極少具有一致性。EP 和 JP 等藥典詳細(xì)描述了有關(guān)這種方法的驗證指南，但其他國家僅僅只是指出 PCR 是一種經(jīng)過驗證的有效檢測方法。不過，所有國家都要求對這種檢測法進(jìn)行適當(dāng)?shù)尿炞C，并與常規(guī)支原體檢測法進(jìn)行比較。

   賽多利斯快速實時 PCR 支原體檢測試劑盒超高靈敏度：起始體積 200μl-18mL, 保證了實驗高的靈敏度 ? 超高特異性：精選 TaqMan® 探針對 110 種支原體的 16S rRNA 基因具有 高度特異性，多個獨(dú)立的實驗室均證 明了這款試劑盒的優(yōu)異性能 ? 超短檢測時間：采用 qPCR 循環(huán)對 樣本 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，通過軟件系統(tǒng) 得到實驗結(jié)果。使檢測時間從幾周縮 短至 3 小時 ? 超低檢測線：檢測線可達(dá) 10CFU/ mL ? 超高安全性：Microsart® 支原體驗證 標(biāo)準(zhǔn)品不具有感染性，確保操作者使的特點(diǎn)。并通過EP 驗證。