代謝組學(xué)研究中標(biāo)準(zhǔn)化的樣本處理與加工是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的關(guān)鍵。本文闡述了如何利用標(biāo)準(zhǔn)化核磁共振（NMR）技術(shù)（例如，基于布魯克-AvanceIVDr平臺）對不同的樣本處理方法進(jìn)行評估，從而對上述觀點加以證實。因此，標(biāo)準(zhǔn)化1H-NMR是一種快速、可靠的生物流體樣本細(xì)微變化監(jiān)測方法。

代謝組學(xué)分析可測量樣本中的所有小分子，包括基質(zhì)、中間代謝物和代謝的最終產(chǎn)物。因此，它可以提供樣本采集時身體功能和狀態(tài)的完整畫面。它還能提供有關(guān)疾病診斷、預(yù)后、治療監(jiān)測以及身體對飲食或環(huán)境變化的反應(yīng)的重要信息。

在代謝組學(xué)研究中，可以使用任何生物流體，但血液和尿液尤為常用，這是因為它們最容易獲得。血液和尿液代謝組能反映出被研究的整個生物體的代謝狀態(tài)，因此會受到健康、疾病和飲食狀況的影響。代謝譜分析通常使用核磁共振（NMR）或色譜質(zhì)譜（LC-MS或GC-MS）來實現(xiàn)。盡管質(zhì)譜法具有更高的靈敏度，但得益于樣本制備、測量和處理的標(biāo)準(zhǔn)化，NMR法更易于操作，且樣本制備量最少，重現(xiàn)性高1。

由于樣本中代謝物的性質(zhì)和濃度將構(gòu)成研究結(jié)論的基礎(chǔ)，因此所分析的化學(xué)成分必須準(zhǔn)確反映出樣本采集時的狀態(tài)。工作流程的差異可能會影響所獲得的結(jié)果，從而增加出現(xiàn)實驗室間差異的可能性。因此，準(zhǔn)確了解樣本處理與加工中的偏差會對代謝曲線產(chǎn)生怎樣的影響，以確保高準(zhǔn)確度和可重復(fù)性分析是非常重要的。

代謝組分析中人工制品的風(fēng)險

代謝譜可能受活動水平、食物攝入量、外部條件和晝夜節(jié)律差異的影響。盡管不可能*排除這種自然的樣本間差異，但通常會在禁食后的一天中的某個時間進(jìn)行抽樣，以盡量減少上述因素的影響。

更可控的是在樣本采集和分析過程中引入不必要的變化的可能性。典型的代謝組工作流程包括幾個關(guān)鍵活動，每個都與分析前階段（樣本采集過程、持續(xù)時間、運(yùn)輸和儲存期間的條件）以及分析階段（樣本制備，所用分析技術(shù)的精確協(xié)議）中的無數(shù)可能變化相關(guān)聯(lián)。

代謝組學(xué)研究中血液和尿液樣本分析前處理的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）被引入，以規(guī)范某些變量，如樣本制備前的時間或離心方法3, 4。

SPIDIA項目（體外診斷通用預(yù)分析程序的標(biāo)準(zhǔn)化）

為了確保代謝組分析的標(biāo)準(zhǔn)化，我們使用核磁共振（NMR）來評估不同分析前處理對代謝組分析用尿液和血液樣本質(zhì)量的影響。最初的研究結(jié)果被用作歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CEN）技術(shù)規(guī)范的基礎(chǔ)，最近還進(jìn)行了進(jìn)一步的研究（SPIDIA4P——個性化藥物體外診斷通用預(yù)分析程序的標(biāo)準(zhǔn)化）。

選擇NMR作為分析方法來進(jìn)行這些分析，是因為它能提供高重復(fù)性、高通量的數(shù)據(jù)，因此可以可靠地比較不同預(yù)分析處理的效果。

禁食血樣是從達(dá)芬奇歐洲生物銀行的存儲庫中獲得的6。將健康受試者的尿樣（禁食條件下的早晨第一次尿液）在2-8°C下儲存，采集后2小時內(nèi)進(jìn)行分析。使用不同的離心和過濾處理方法對每個樣本進(jìn)行分離與分析7。采用布魯克 AvanceIVDr 600 MHz系統(tǒng)，并遵循樣本制備與分析的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，獲取所有樣本的1H NMR譜。

尿代謝譜改變的根源

盡管除細(xì)胞外只有少量的酶存在，但正在進(jìn)行的化學(xué)與酶反應(yīng)也可能改變尿液的成分。事實上，在處理過的和未處理過的尿樣中都檢測出一些信號強(qiáng)度以及新代謝物的出現(xiàn)7。通常，乙酸酯、琥珀酸鹽和肌酸鹽會隨時間而增加，丙酮酸鹽、肌酐和2-氧戊二酸鹽則會減少。

變化的主要根源是氧化還原反應(yīng)，雖然不能*避免，但通過在整個分析和預(yù)分析過程中使樣本保持在低溫下并減少與空氣接觸可以盡量減少這種反應(yīng)。疊氮化物在NMR緩沖液中的存在不影響這些變化的程度。儲存在-80℃的樣本在保存5年后仍然完好7。

血清與血漿

紅細(xì)胞的活性會引起重要代謝物的濃度變化，如葡萄糖、乳酸和丙酮酸，因此樣本應(yīng)在采集后30分鐘內(nèi)進(jìn)行處理以去除細(xì)胞。與尿液一樣，氧化反應(yīng)也會引起變化，從而影響其它代謝物的濃度，如脯氨酸和檸檬酸鹽7。同樣，在整個分析和預(yù)分析過程中使血液樣本保持在低溫下也能減少其成分的變化。儲存在-80℃的血液樣本在保存5年后仍然完好。

此外，Ficoll梯度離心法已被證明會強(qiáng)烈干擾血液樣本的代謝譜，遮掩重要的代謝物，包括葡萄糖和乳酸7。使用EDTA和檸檬酸鹽時，譜信號丟失較少。

總的來說，這些新結(jié)果進(jìn)一步證實了CEN建議文件的有效性。此外，作者還證實了1H-NMR是一種快速、可靠的樣本質(zhì)量評價與樣本處理、儲存過程驗證方法。

 參考文獻(xiàn)：

1. Markley JL, et al. Curr. Biotechnol. 2017;43:34e40

2. Giskeødegård GF, et al. Sci. Rep. 2015;5:14843

3. Bernini P, et al. J. Biomol. NMR 2011;49:231 243. https://doi.org/10.1007/s10858-011-9489-1

4. Emwas A-H, et al. Metabolomics 2015;11:872–894. https://doi.org/10.1007/s11306-014-0746-7.

5. Takis PG, et al. Trac Trends Anal Chem 2019;120:115300 https://doi.org/10.1016/j.trac.2018.10.036.

6. Ghini V, et al. Metabolomics 2015;11:1769–78. https://doi.org/10.1007/s11306-015-0832-5.

7. Ghini V, et al. New Biotechnology 2019;52:25–34. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2019.04.004