格列本脲通過(guò)代謝調(diào)節(jié)的表觀遺傳修飾靶向MDH2來(lái)緩解衰老表型

研究背景：

抗衰老藥物開(kāi)發(fā)的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是有效靶點(diǎn)的確定。表觀遺傳失調(diào)已成為衰老的關(guān)鍵標(biāo)志和驅(qū)動(dòng)力，這表明改善這種失調(diào)可能是緩解衰老表型的一種有希望的策略。據(jù)報(bào)道，補(bǔ)充代謝物，包括NAD+前體，α-酮戊二酸鹽等，在一定程度上通過(guò)表觀遺傳調(diào)控表現(xiàn)出恢復(fù)青春的作用。然而，小分子化合物在代謝過(guò)程中靶向酶是否能夠通過(guò)代謝-表觀遺傳調(diào)控來(lái)緩解衰老表型，這在很大程度上仍然未知。

前期研究發(fā)現(xiàn)氯磺丙脲（chlorproamide, Chl）是磺脲類(lèi)化合物，通過(guò)線粒體相關(guān)途徑對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)發(fā)揮抗衰老作用，然而Chl和磺酰脲類(lèi)化合物的抗衰老作用靶點(diǎn)尚不清楚。

研究結(jié)果：

1、MDH2調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老

使用基于先前報(bào)道的靶向線粒體的抗衰老化合物（Chl）設(shè)計(jì)的化學(xué)探針（Chl- p），進(jìn)行了基于活性的蛋白質(zhì)譜分析（ABPP，由百泰派克提供），以發(fā)現(xiàn)磺脲類(lèi)藥物的潛在抗衰老靶點(diǎn)（圖1a）。在通過(guò)原位Chl- p標(biāo)記和人胚胎肺成纖維細(xì)胞（MRC-5細(xì)胞）中10倍Chl競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)到的蛋白質(zhì)中，MDH2成為一個(gè)潛在的靶標(biāo)（圖1a），因?yàn)樗诰€粒體代謝中的功能與之前報(bào)道的磺脲類(lèi)藥物的抗衰老機(jī)制有關(guān)。

用免疫印跡法測(cè)定了阿霉素（Dox）誘導(dǎo)衰老的 MRC-5細(xì)胞（圖1b，c）和復(fù)制衰老的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）（圖 1d，e）中 MDH2 的水平。結(jié)果顯示 MDH2 水平與細(xì)胞衰老呈正相關(guān)（圖1b-e）。MDH2敲除和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，MDH2 可調(diào)控體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的衰老過(guò)程。

圖1 MDH2調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老

2、Gli抑制MDH2，延緩細(xì)胞衰老和小鼠衰老

為了測(cè)試磺酰脲類(lèi)藥物對(duì)MDH2的影響，評(píng)估了重組MDH2在不同磺酰脲類(lèi)藥物（包括Chl、Glibenclamide（Gli）、tolbutamine （Tolb）、gliclaide （Glic）和gllipizide (Glip)）處理下的活性。其中Gli對(duì)MDH2的抑制率最高，而Chl僅表現(xiàn)出微弱的抑制作用。為了驗(yàn)證Gli和MDH2之間的相互作用，合成了一種化學(xué)探針（Gli- p）（圖2a）。在MRC-5細(xì)胞中，Gli- p對(duì)MDH2的原位標(biāo)記被8倍Gli顯著競(jìng)爭(zhēng)（圖2b），表明Gli和MDH2之間存在直接相互作用。測(cè)定Gli與MDH2的結(jié)合常數(shù)（KD）為23.9 μM（圖2c），證實(shí)了Gli與MDH2的相互作用。Gli對(duì)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色的緩解效果優(yōu)于Chl（圖2d，e）。

其他細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Gli延緩了Dox誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老和復(fù)制性衰老，減輕了細(xì)胞衰老過(guò)程中DNA損傷的積累。小鼠模型結(jié)果也證實(shí)了Gli作為MDH2抑制劑在體內(nèi)具有抗衰老作用。

圖2 Gli在體內(nèi)和體外均可緩解衰老表型

3、Gli緩解依賴(lài)于MDH2的細(xì)胞衰老

為了確定Gli緩解細(xì)胞衰老的作用是否依賴(lài)于MDH2，創(chuàng)建了MDH2敲低和過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型，并測(cè)試Gli對(duì)衰老標(biāo)志物的影響。結(jié)果顯示，在敲低的細(xì)胞中，抵消了Chl和Gli的影響，而Gli比Chl更能減輕SA-β-gal染色。過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)Gli降低p16INK4a表達(dá)（圖3f，g）和SA-β-gal陽(yáng)性（圖3h，i）的程度與陰性對(duì)照相同。這些結(jié)果表明Gli以MDH2依賴(lài)的方式延緩細(xì)胞衰老。

圖3 Gli緩解依賴(lài)于MDH2的細(xì)胞衰老

4、Gli通過(guò)抑制MDH2調(diào)節(jié)中樞碳代謝

之前的研究表明，Chl誘導(dǎo)復(fù)合體II衍生的線粒體活性氧（mtROS）。在Gli處理的細(xì)胞中，MitoSOXTM的熒光增加（圖4a），這與之前的報(bào)道一致。為了進(jìn)一步研究Gli或sh-MDH2對(duì)能量代謝的影響，檢測(cè)了亞細(xì)胞乳酸水平。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的乳酸水平升高（圖 4b），這表明 MDH2 抑制劑會(huì)導(dǎo)致TCA循環(huán)抑制，從而誘導(dǎo)有氧糖酵解。

在使用或不使用Gli處理的細(xì)胞（2 h）中進(jìn)行靶向代謝檢測(cè)，結(jié)果顯示，不同組間的代謝物主要涉及 “癌癥中樞碳代謝 "和 “蛋白質(zhì)消化吸收 "過(guò)程（圖 4c）。糖酵解中間產(chǎn)物被下調(diào)（圖 4d），而TCA循環(huán)中間產(chǎn)物（圖4e）和構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)的全部20種氨基酸（圖4f）被上調(diào)。處理24 h后，只有TCA 循環(huán)癌癥中的中心碳代謝中的代謝物富集（圖 4g）。糖酵解中間產(chǎn)物（圖 4h）和 18 種氨基酸（圖 4j）的水平得到恢復(fù)，而 TCA 循環(huán)中間產(chǎn)物的水平仍然上調(diào)（圖 4i）。這些結(jié)果證實(shí)了 Gli 直接靶向TCA循環(huán)并保持其代謝改變，而其他代謝途徑的改變?cè)陂L(zhǎng)期使用 Gli 治療中可以得到補(bǔ)償。

為了證實(shí)Gli通過(guò)抑制MDH2調(diào)控中心碳代謝，測(cè)定了Gli處理2小時(shí)后sh-Scr和sh-MDH2細(xì)胞中不同代謝物的含量。結(jié)果顯示，在Gli處理和sh-MDH2細(xì)胞中，MDH2催化的從蘋(píng)果酸到草酰乙酸的轉(zhuǎn)化被阻斷。Gli還下調(diào)了sh-Scr細(xì)胞中的氨基酸水平，而 sh-MDH2的作用被抵消了。這些結(jié)果表明，Gli 以依賴(lài) MDH2 的方式調(diào)節(jié)碳代謝中心的代謝物。

圖4 Gli以TCA循環(huán)為目標(biāo)，調(diào)節(jié)中樞碳代謝

5、MDH2抑制調(diào)節(jié)SAH代謝和組蛋白甲基化

在依賴(lài)于MDH2的26種Gli調(diào)控的差異代謝物中（圖5d，橙色字體），補(bǔ)充S-腺苷高半胱氨酸（SAH）zuì xiǎn zhù地降低了p16INK4a的表達(dá)（圖 5e）。Gli處理后，細(xì)胞內(nèi)SAH水平下降，而S-腺苷甲硫氨酸（SAM）水平上升（圖5f）。這些結(jié)果表明，MDH2 抑制增強(qiáng)了蛋氨酸循環(huán)通量，該通量將SAH水解為高半胱氨酸，并以蛋氨酸為底物合成SAM（圖 5g）。在組蛋白甲基化位點(diǎn)中，Gli 在1天的處理中上調(diào)了H3K27me3水平，而H3K4me3和 H3K9me3水平未受影響（圖 5h，i）。在5天的處理中，H3K4和H3K27的三甲基化都增加了（圖 5j，k）。由于組蛋白甲基化對(duì)蛋氨酸代謝的動(dòng)態(tài)很敏感，這些表型支持了在 MDH2 抑制下蛋氨酸循環(huán)通量的激活。

其他衰老細(xì)胞結(jié)果顯示，Gli上調(diào)了NRK-52E細(xì)胞中H3K4me3和H3K27me3的水平，而SAH只誘導(dǎo)了H3K4的三甲基化，這表明在MDH2抑制下，H3K27me3是甲基化的關(guān)鍵位點(diǎn)，可以延緩細(xì)胞衰老。

圖5 DA增加了UUO腎臟中p-β-catenin (S33/37/45/T41)，降低了總β-catenin含量

6、體內(nèi)抑制MDH2延緩肝臟衰老，上調(diào)H3K27me3

通過(guò)肝臟特異性敲低MDH2和Gli處理，檢測(cè)相關(guān)標(biāo)志物和組蛋白修飾。結(jié)果顯示，敲低MDH2或Gli處理均能顯著降低衰老小鼠肝臟中p16INK4a的表達(dá)水平，并上調(diào)H3K27me3水平。研究結(jié)果表明MDH2抑制（通過(guò)Gli或sh-Mdh2）干擾TCA循環(huán)，增強(qiáng)蛋氨酸循環(huán)通量，誘導(dǎo)H3K27me3的甲基化修飾，從而通過(guò)代謝-表觀遺傳調(diào)控減輕細(xì)胞衰老和組織衰老（圖7）。

圖6 抑制 MDH2 可延緩肝臟衰老并提高體內(nèi) H3K27me3 水平

圖7 抑制 MDH2 的代謝表觀遺傳調(diào)控抗衰老作用示意圖

研究結(jié)論：

研究介紹了一種通過(guò)靶向MDH2來(lái)緩解衰老表型的新方法，從而增強(qiáng)蛋氨酸循環(huán)通量并逆轉(zhuǎn)組蛋白甲基化的年齡相關(guān)改變。Gli作為MDH2的小分子抑制劑，是一種很有前景的先導(dǎo)化合物，可以通過(guò)修飾獲得最佳的MDH2抑制活性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)?；贕li的衍生物可以更好地靶向MDH2，在通過(guò)代謝干預(yù)延緩衰老和減輕年齡相關(guān)疾病方面具有很大的治療潛力。

參考文獻(xiàn)：Mao, Z., Liu, W., Zou, R. et al. Glibenclamide targets MDH2 to relieve aging phenotypes through metabolism-regulated epigenetic modification. Sig Transduct Target Ther 10, 67 (2025).

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