（1）標準的PCR反應條件：

10X緩沖液：10 μL

4種dNTP混合物：各200umol/L

引物：各10～100pmol

模板DNA：0.1～2μg

Taq DNA聚合酶：2.5U

Mg2+ ：1.5mmol/L

（2）PCR反應過程：

（3）PCR反應特點：

靈敏度高

皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平

能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞

病毒檢測的靈敏度可達3個RFU

細菌檢測的最小檢出率為3個細菌

簡便、快速

一次性加好反應液，2～4 小時完成擴增

擴增產物一般用電泳分析

對標本的純度要求低

血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNA

PCR反應體系

以DNA為模板的反應

反應體積：50~100μl

緩沖液

引物

底物：4種dNTP

模板：102~105拷貝

TaqDNA聚合酶

礦物油

以mRNA為模板的反應（逆轉錄PCR）

逆轉錄反應體系

體積：20 μl

緩沖液

底物：4種dNTP

引物：oligo(dT)12~18

模板：RNA

逆轉錄酶

其他試劑：RNA酶抑制劑，

MgCl2.DTT.牛血清白蛋白

PCR反應體系同以DNA模板的反應體系

（一）PCR反應成分

1、模板

  單、雙鏈DNA均可。

  不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結合蛋白類。

  一般100ng DNA模板/100mL。

  模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。

2、引物濃度

    0.1-0.5 mmol/L

    濃度過低影響產量，偏高引起錯配和非特異性產物增加，且可增加引物二聚體的產生幾率。

3、Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)

    0.5-2.5 U/50 ml

    酶量增加使反應特異性下降;酶量過少影響反應產量。

4、dNTP  20~200μmol/L

      dNTP濃度取決于擴增片段的長度

      四種dNTP濃度應相等

     濃度過高易產生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產量，但特異性增加

     dNTP可與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。

5、 Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。

0.5mmol/L-2.5mmol/L反應體系。

Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產量下降； Mg2+過高影響反應特異性。

Mg2+可與負離子結合，所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。

6、 PCR反應的緩沖液

10~50mmol/L Tris-Cl 緩沖液，72℃ 時pH 7.2,調節(jié)反應體系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用環(huán)境維持偏堿性。緩沖液含50 mmol/L的KCl可促進引物退火，大于此濃度將會抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入適量二甲基亞砜或甲酰胺有利于破壞模板的二級結構。

（二）循環(huán)參數

1、變性  

    94oC~95oC，30-60 s

   且最初在加Taq酶之前先于97oC充分變性5~10min

2、退火  

    50oC~55oC，60-90 s

    增加溫度能減少引物與模板的非特異性結合;

    降低溫度可增加反應的靈敏性。

3、延伸

      70oC~74oC，60-120 s

      延伸時間由擴增片段長度決定

4、循環(huán)次數

     主要取決于模板DNA的濃度，一般為25-35次

    次數過多：非特異擴增增加

（三）PCR產物的積累規(guī)律

在PCR反應中，DNA擴增過程遵循酶的催化動力學原理。反應初期，目的DNA片段呈指數擴增。隨著目的DNA產物逐漸積累，擴增DNA片段的增加減慢進入相對穩(wěn)定狀態(tài)，即出現“停滯效應"，又稱“平臺期"。到達平臺期所需PCR循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝數、PCR擴增效率、DNA聚合酶種類和活性、以及非特異產物的競爭等因素。到達平臺期前，TaqDNA聚合酶一般要進行25次以上PCR循環(huán)。

多數情況下，平臺期在PCR反應中不可避免。

PCR產物的積累規(guī)律示意圖