五、PCR引物的設(shè)計

（一）一般原則

1、引物長度在15～30堿基。引物過短，會使特異性降低。過長會提高相應(yīng)的退火溫度，且合成引物的成本增加。

2、引物中堿基的分布是隨機的，避免4個以上的嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，G+C含量宜在

  45～55％左右。

3、避免兩引物間的互補，特別是3‘端互補，以免形成二聚體。

4、引物自身不應(yīng)存在連續(xù)超過3bp的互補序列， 否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物本身變性。

5、引物的3’端不能有任何修飾，也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能。

6、引物的5’端限定著PCR產(chǎn)物的長度，可根據(jù)產(chǎn)物的要求不同， 可以選用不同的引物修飾法。

7、引物與非擴增序列的同源性不應(yīng)超過70％。

（二）引物設(shè)計的方法

1、直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁。

2、引物設(shè)計軟件。功能：首先是引物分析評價功能，其中以“Oligo 6"為優(yōu)秀；其次是引物的自動搜索功能，各種軟件在這方面的側(cè)重點不同。

六、PCR產(chǎn)物的檢測

（一）瓊脂糖凝膠電泳

是PCR擴增產(chǎn)物的分離、純化和鑒定常用的方法。其分辨率很高，可測出1ng DNA。一般800bp以上的片段用0.8%的膠，800bp以下的片段用1.0%～2.0%的膠。

（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳

靈敏度比瓊脂糖凝膠電泳高，主要用于分離制備小于1kb長度的低分子質(zhì)量基因片段，因此特別適用于合成的基因片段的分離和檢測。適用于PCR擴增效率低時產(chǎn)物的檢測。根據(jù)擴增片段的大小選擇合適的膠濃度，電泳后可用銀染或溴乙錠染色檢測，銀染比EB染色檢測靈敏度高2～10倍。

（三）層析技術(shù)

高效液相色譜(HPLC)是在常壓基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項現(xiàn)代化分析技術(shù)，其特點是分離速度快、效果好，是目前基因片段分離純化所廣泛采用的方法之一。

離子交換層析（ IEC ）的基礎(chǔ)是溶質(zhì)分子所攜帶的電荷，而合成的基因片段恰好具有這一性質(zhì)。因此，IEC分析廣泛應(yīng)用于DNA的合成及其擴增后的分離純化。

（四）分子雜交

為了確定PCR產(chǎn)物是否是預(yù)先設(shè)計的目的片段，或產(chǎn)物是否有突變，都需做分子雜交檢測。分子雜交包括點雜交和Southern印跡雜交。點雜交靈敏度較高，特別適用于特異性不高的PCR擴增產(chǎn)物分析。

 Southern印跡雜交可鑒定PCR產(chǎn)物的大小和特異性，檢測靈敏度可達10ng?；具^程是PCR產(chǎn)物進行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，然后，印跡轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，再用標記的探針進行雜交檢測。

（五）限制性內(nèi)切酶酶切分析

若知道PCR擴增片段的序列或限制性內(nèi)切酶酶切圖譜，則可選擇合適的限制酶消化PCR產(chǎn)物，再進行電泳分析，根據(jù)PCR酶切產(chǎn)物的電泳圖譜，可判定PCR產(chǎn)物的特異性及是否存在突變。

（六）PCR擴增產(chǎn)物的直接測序

直接序列分析是指在PCR擴增基因組DNA序列的基礎(chǔ)上，直接進行基因核苷酸序列分析的方法，是檢測基因突變有效、直接的方法。

七、PCR中應(yīng)注意的事項

（一）防止污染

試劑小量分裝

吸頭及Ep管一次性使用

器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作

（二）設(shè)立對照：

陽性對照：陽性模板

陰性對照：陰性模板

試劑對照：除模板外的所有組分