Gyrolab平臺(tái)采用自動(dòng)化進(jìn)樣方式在微流控CD上進(jìn)行小型化免疫檢測(cè)。CD微結(jié)構(gòu)中填裝鏈霉親和素包被的親和微珠，通過生物素化捕獲試劑與分析物特異性相結(jié)合，再與熒光標(biāo)記的檢測(cè)試劑結(jié)合，通過激光激發(fā)親和柱上的熒光信號(hào)并用檢測(cè)器對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行讀數(shù)。Gyrolab免疫測(cè)定法具有自動(dòng)化、通量高、節(jié)省時(shí)間、試劑與樣品用量少、動(dòng)態(tài)范圍廣和基質(zhì)效應(yīng)低等優(yōu)勢(shì)，已在生物藥物研發(fā)和生產(chǎn)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
Gyrolab采用均相橋聯(lián)格式 (homogenous bridgingformat) 檢測(cè)ADA， 藥物分子同時(shí)用作捕獲試劑 (生物素化) 和檢測(cè)試劑 (Alexa Fluor® 647熒光標(biāo)記) ，樣品和試劑混合后再加入CD 微結(jié)構(gòu)的鏈霉親和素柱中，然后檢測(cè) ADA 或陽性對(duì)照在生物素化的藥物分子和熒光團(tuán)標(biāo)記的藥物分子之間形成橋接復(fù)合物 。這種檢測(cè)形式可檢測(cè)所有同種型的 ADA (IgG、IgM、IgA 等) 且不依賴于物種，既可用于臨床前也可用于臨床研究。
Gyrolab平臺(tái)提供ADA檢測(cè)的完整解決方法，簡(jiǎn)化從篩選試驗(yàn)到確證試驗(yàn)開發(fā)的工作流程，包括ADA分析軟件模塊、Rexxip ADA樣品稀釋緩沖液和兩種不同格式的CD。
Gyrolab Mixing CD 96是專用于酸解法檢測(cè)ADA的微流控CD，它將樣品酸解離預(yù)處理步驟整合到自動(dòng)化檢測(cè)流程中。每片Mixing CD上有96個(gè)微結(jié)構(gòu)，每個(gè)微結(jié)構(gòu)中均有一個(gè)樣品混合室可用于樣品孵育和酸解離。進(jìn)行ADA檢測(cè)時(shí)，首先將樣品加入微結(jié)構(gòu)中的體積定義通道，200 nL樣品在CD離心力作用下進(jìn)入混合室，接著加入酸性緩沖液到混合室中，ADA-藥物復(fù)合物可在低 pH 環(huán)境中解離。然后將含有捕獲試劑和檢測(cè)試劑的 Master Mix中和緩沖液中加入混合室，ADA分子與標(biāo)記試劑接觸并形成新的 ADA 復(fù)合物。這樣使標(biāo)記試劑與未標(biāo)記游離藥物的比例有利于形成可檢測(cè)的標(biāo)記試劑-ADA橋接復(fù)合物，最后將復(fù)合物捕獲到鏈霉親和素包被的微珠上，并通過激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。這一檢測(cè)流程實(shí)現(xiàn)了從樣品試劑添加、在線酸解離再到信號(hào)檢測(cè)的全自動(dòng)化，自動(dòng)化程序精確控制每個(gè)步驟的時(shí)間和反應(yīng)體積，最大限度地減少了動(dòng)手操作，不僅顯著提高了檢測(cè)精確度，而且大幅縮短了分析時(shí)間。
Gyrolab支持兩種不同的樣品預(yù)處理方式來克服游離藥物對(duì)ADA檢測(cè)的干擾，可根據(jù)藥物特性和應(yīng)用情況靈活選擇適用的方法。使用Gyrolab技術(shù)進(jìn)行ADA檢測(cè)的主要優(yōu)勢(shì)包括：
納升級(jí)的反應(yīng)體系，試劑和樣品用量少
自動(dòng)在線酸解離，提高檢測(cè)精密度
親和柱流穿技術(shù)將基質(zhì)效應(yīng)最小化，提高檢測(cè)靈敏度和藥物耐受性
親和柱高載量更有利于高濃度的標(biāo)記試劑與游離藥物競(jìng)爭(zhēng)，通過計(jì)量?jī)?yōu)勢(shì)進(jìn)一步提高藥物耐受性
分析速度快，每片CD的運(yùn)行時(shí)間約1小時(shí)，采用Mixing CD 96在線酸解離檢測(cè)運(yùn)行時(shí)間約2小時(shí)
動(dòng)手操作少，減少人為誤差
專用ADA軟件模塊按照監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)篩選試驗(yàn)和確證試驗(yàn)開發(fā)流程
免疫原性檢測(cè)方法的關(guān)鍵參數(shù)包括檢測(cè)靈敏度、藥物耐受性和選擇性。藥物耐受性是指在殘留治療藥物的情況下檢測(cè)抗藥物抗體 (ADA) 的能力, 評(píng)估游離藥物與ADA的結(jié)合情況是為了避免出現(xiàn)假陰性的風(fēng)險(xiǎn)。選擇性是指在正?；|(zhì)或疾病基質(zhì)的情況下評(píng)估檢測(cè)的穩(wěn)健性，對(duì)于確保臨床研究中評(píng)估不同樣本時(shí)的一致性至關(guān)重要。另外，在使用橋聯(lián)法進(jìn)行ADA檢測(cè)時(shí)的一大挑戰(zhàn)是靶點(diǎn)的干擾，臨床樣本中存在的二聚體或多聚體形式的可溶性靶點(diǎn)可能會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
Novimmune SA公司研究人員在開發(fā)針對(duì)一種治療性抗體藥物 (Novimab) 的ADA檢測(cè)方法的過程中，采用Gyrolab和ECL (Electochemiluminescence, ECL) 技術(shù)對(duì)不同方式處理的樣品進(jìn)行了檢測(cè) (靶點(diǎn)耗竭樣品、非靶點(diǎn)耗竭樣品、酸化樣品和非酸化樣品) ，并對(duì)兩種檢測(cè)方法的關(guān)鍵參數(shù)例如靈敏度、藥物耐受性和靶點(diǎn)耐受性進(jìn)行了評(píng)估和比較，以獲得符合目的 (Fit-for-purpose) 的臨床免疫原性檢測(cè)方法[1]。
研究人員使用生物素化的藥物作為捕獲試劑，Alexa Fluor® 647標(biāo)記 (Gyrolab) 或Sulfo-tag標(biāo)記 (ECL) 的藥物作為捕獲試劑，純化的多克隆兔抗藥物抗體作為ADA陽性參照物，在兩個(gè)平臺(tái)上以均相橋聯(lián)格式進(jìn)行ADA檢測(cè)。Gyrolab平臺(tái)使用Bioaffy 200 CD進(jìn)行非酸化樣品檢測(cè)，Mixing CD 96進(jìn)行酸化樣品檢測(cè)，樣品酸解離和中和在Mixing CD上自動(dòng)完成。
在三天里對(duì)一個(gè)陰性對(duì)照樣品(NC) 和九個(gè)陽性對(duì)照樣品 (PC , 2、5、20、50、100、250、500、1000 和 10000 ng/mL ADA) 進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù) 3 次檢測(cè)間運(yùn)行的結(jié)果確定靈敏度，即持續(xù)返回高于閾值信號(hào)的z低 PC 濃度。
兩種方法的靈敏度都很高，低于100 ng/mL。對(duì)于非酸化樣品檢測(cè)，Gyrolab和ECL平臺(tái)的靈敏度均為2 ng/mL；對(duì)于采用酸解離步驟的樣品，Gyrolab檢測(cè)的靈敏度為5 ng/mL, 高于ECL的20 ng/mL的靈敏度。
在非酸解和酸解離條件下，Gyrolab和ECL平臺(tái)對(duì)PC樣品檢測(cè)的信號(hào)值。X軸為ADA參照物濃度，Y軸為信噪比 (PC 信號(hào)均值除以 NC 信號(hào)均值)
在兩個(gè)平臺(tái)上使用經(jīng)優(yōu)化后的最佳條件，分別對(duì)酸化和非酸化樣品的檢測(cè)進(jìn)行了比較研究：在含有 0、20 和 100 µg/mL單抗藥物的情況下，對(duì)九種 PC 樣品 (5、20、50、100、250、500、1000、2500 和 10000 ng/mL ADA) 進(jìn)行了檢測(cè)，數(shù)據(jù)顯示Gyrolab 平臺(tái)顯示出更高的藥物耐受性。對(duì)于未經(jīng)酸化的樣品檢測(cè)，在 20 µg/mL和 100 µg/mL的藥物濃度下，Gyrolab可分別檢測(cè)到 100 ng/mL 和 500 ng/mL 的 ADA，ECL平臺(tái)可分別檢測(cè)到 250 ng/mL 和 1000 ng/mL 。對(duì)于酸解離樣品檢測(cè)，在藥物濃度為20 µg/mL時(shí)，Gyrolab可檢測(cè)到5 ng/mL ADA, ECL平臺(tái)為50 ng/mL；當(dāng)藥物濃度水平提高到100 µg/mL時(shí)，兩種平臺(tái)的檢測(cè)靈敏度均為50 ng/mL ADA。
在藥物水平為0, 20和100 µg/mL的條件下，兩種平臺(tái)的檢測(cè)靈敏度。靈敏度定義為超過閾值信號(hào)的z低PC濃度。
在本研究中，可溶性靶點(diǎn)可能形成二聚體干擾檢測(cè)造成假陽性結(jié)果，而且在疾病人群中，可溶性二聚體靶點(diǎn)的基礎(chǔ)水平可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康人血清中測(cè)得的水平，所以提高檢測(cè)方法的靶點(diǎn)耐受性對(duì)于臨床分析非常重要。
為了評(píng)估靶點(diǎn)耗竭步驟的效率，將含有四種不同濃度可溶性二聚體靶點(diǎn) (5、20、50 和 200 ng/mL) 的樣品分成兩組，一組進(jìn)行靶點(diǎn)耗竭前處理，另一組則不做靶點(diǎn)耗竭，然后分別在兩個(gè)平臺(tái)上進(jìn)行有/無酸解離步驟的檢測(cè)。數(shù)據(jù)顯示，在沒有酸解離的情況下，Gyrolab和ECL檢測(cè)都只能耐受5 ng/mL 的可溶性二聚體靶點(diǎn)；通過將靶點(diǎn)耗竭和酸解離步驟結(jié)合，兩個(gè)平臺(tái)的靶點(diǎn)耐受水平都提高到了200 ng/mL。
在無酸解離或無靶點(diǎn)耗竭步驟條件下，評(píng)估兩個(gè)平臺(tái)在不同可溶性二聚體靶點(diǎn)濃度下的耐受性。虛線所代表的閾值固定為信噪比1.25。
兩個(gè)平臺(tái)在不同可溶性二聚體靶點(diǎn)濃度下的檢測(cè)結(jié)果，符號(hào) "+"和"-"分別表示樣本信號(hào)高于或低于閾值。
使用僅含有游離ADA的樣本進(jìn)行了檢測(cè)間精密度評(píng)估，包括酸解離樣品和未經(jīng)酸解離樣品的檢測(cè)。在不同日期使用ECL平臺(tái)對(duì)九種不同濃度的 PC (2、5、20、50、100、250、500、1000 和 10000 ng/mL) 進(jìn)行3次獨(dú)立檢測(cè)，使用Gyrolab平臺(tái)對(duì)五種不同濃度的PC (5、20、100、500 和 10000 ng/mL) 進(jìn)行5次獨(dú)立檢測(cè)，根據(jù)每種 PC 水平獲得的信號(hào)值計(jì)算運(yùn)行間精密度 (CV%)。數(shù)據(jù)顯示，在沒有酸解離步驟的情況下，Gyrolab和ECL檢測(cè)的精密度都很高，所有 PC 樣品的CV均低于 10%；但在酸解離檢測(cè)中，明顯觀察到ECL檢測(cè)的CV從10%增加到 26%，而Gyrolab檢測(cè)依然保持了良好的精密度，除5 ng/mL PC樣品外，其他樣品檢測(cè)的CV均低于10%。這是因?yàn)?strong>Gyrolab技術(shù)采用全自動(dòng)化酸解離處理，減少了人工操作和誤差，從而降低了結(jié)果的變異性。
檢測(cè)間精密度，“NT" 表示未進(jìn)行檢測(cè)，“<blq"< span="">表示低于方法檢測(cè)靈敏度。
本研究數(shù)據(jù)顯示，Gyrolab和 ECL技術(shù)在ADA檢測(cè)的靈敏度、藥物耐受性、靶點(diǎn)耐受性和精密度等參數(shù)方面均表現(xiàn)出良好的性能，兩種檢測(cè)方法都適用于方法驗(yàn)證和臨床樣本分析
對(duì)采用酸解離步驟的樣品檢測(cè)，Gyrolab具有更高的檢測(cè)靈敏度和藥物耐受性
Gyrolab平臺(tái)集成全自動(dòng)樣品酸解離，減少了動(dòng)手操作和誤差，提高了檢測(cè)間的結(jié)果重復(fù)性
Gyrolab檢測(cè)所需的試劑量更少，檢測(cè)運(yùn)行時(shí)間更短，通量更高
參考文獻(xiàn)：
[1] Collet-Brose J, Couble PJ, Deehan MR, Nelson RJ, Ferlin WG, Lory S. Evaluation of Multiple Immunoassay Technology Platforms to Select the Anti-Drug Antibody Assay Exhibiting the Most Appropriate Drug and Target Tolerance. J Immunol Res. 2016;2016:5069678. doi: 10.1155/2016/5069678. Epub 2016 May 3. PMID: 27243038; PMCID: PMC4868908.
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