上一期中我們簡單介紹了Orbitrap Exploris™ 480的設計原則和硬件性能，在這期的微信稿中我們一起來領略一下Exploris 480的強悍性能，以及新的軟件特性如何將蛋白質組學推向一個新的高度。

 

1.Orbitrap Exploris™ 480的鑒定性能

Exploris 480是在Q Exactive HF-X的基礎上改進而來，因此其性能指標也是達到了新的高度。其掃描速度為40Hz，與Q Exactive HF-X一致。相比Q Exactive HF-X，Exploris 480有著更高的分辨率和靈敏度，更寬的質量范圍和更為豐富的定量模式和選裝模塊。

 

性能指標

質量范圍	40-6000m/z（可選8000m/z）
四極桿分離	低至 0.4u
掃描速度	高至 40Hz
分辨率	480k（m/z 200時）
動態(tài)范圍	＞5000:1
質量準確度	3 ppm RMS ext, 1 ppm RMS int.
碎裂方式	高能量碰撞解離（HCD）
分析器	四極桿，Orbitrap
體積緊湊	530 x 760 x 700 mm (w,d,h)
可選項	Easy-IC, BioPharma, FAIMS Pro

 

性能：強悍的性能指標帶來的是不斷突破記錄的鑒定能力

 

上樣500ng – 1μg Hela全細胞酶解產物，單針60分鐘的梯度可實現(xiàn)超過5,000個蛋白的鑒定（圖1）。

圖1. 60分鐘梯度Exploris 480的蛋白鑒定數(shù)量

 

非標定量

在Hela細胞樣品中摻入酵母樣品來考察非標記定量的準確性亦得到了非常優(yōu)良的結果，由于動態(tài)范圍和譜圖質量的提升，在非標記定量的實驗中“Match Between Runs"組件的效果得到了更加明顯的體現(xiàn)（圖2）。

圖2. Orbitrap Exploris™ 480進行非標記定量的性能評估（點擊查看大圖）

 

 

2.兼容全新一代FAIMS Pro，進一步提升定性定量能力

在2018年9月份的HUPO上，賽默飛推出了全新一代的FAIMS Pro (High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry, 高場非對稱波形離子遷移譜)，該接口可搭載于TNG系列的質譜儀，例如Orbitrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos質譜儀。搭載該接口可顯著提升質譜的定性定量能力，一經(jīng)面世即受到市場的熱捧。

Orbitrap Exploris™ 480也采用了TNG式樣的離子源，因此可以選配FAIMS Pro來進一步提升儀器能力。FAIMS Pro是一種大氣壓條件下的離子遷移譜，對于肽段樣品來說主要通過肽段帶電性質的不同來進行分離，從而作為一種在線的氣態(tài)樣品分級手段來提高復雜樣品的定性和定量效率（具體內容請見相關閱讀）[1, 2]。將FAIMS Pro作為在線分級手段分別用-40CV/-55CV/-65CV進行60分鐘采集的話可輕松實現(xiàn)54,000+個unique peptide, 對應6,300+個蛋白的鑒定。

3.TMT定量體驗

困擾：對于10標以及11標的TMT定量來說我們一直受到兩個問題的困擾。

1個問題

10標TMT的相鄰報告離子基團僅存在質量虧損級的質量差異，因此我們需要采用50,000的分辨率進行采集，從而使得掃描速度變慢，降低了對樣品的測序深度。

 

2第二個問題

共流出肽段的干擾，由于Q Exactive系列儀器無法采集三級質譜，因此我們只能在采集二級質譜時通過減小母離子隔離窗口，并且關閉APD選項，然后在數(shù)據(jù)后處理時篩選干擾小于25%的二級譜圖來進行TMT定量從而盡可能的緩解這一影響。

 

解決：這一系列問題在Orbitrap Exploris™ 480上都給出了的解決辦法。

 

1對于個問題

對于個問題, Exploris 480上搭載了Turbo-TMT選項，該選項實現(xiàn)了在低分辨采集模式下（Res = 15,000）通過ΦSDM的譜圖后處理算法使得報告離子的分辨率達到了50,000，從而輕松區(qū)分僅存在質量虧損級差異的報告離子（圖3）。這樣就實現(xiàn)了在不影響報告離子分辨率的情況下極大的提升了譜圖掃描的速度，從而保證了復雜樣品的測序深度。

圖3. Turbo-TMT選項的工作流程示意（點擊查看大圖）

 

2對于第二個問題

而對于共流出肽段干擾的問題，Exploris 480給出了兩個非常聰明的解決辦法。一是Precursor Fit的二級觸發(fā)選項; 二是FAIMS Pro用于基于價態(tài)的肽段分級。Precursor Fit選項通過一級質譜的數(shù)據(jù)計算目標母離子在隔離窗口的含量，只有當目標母離子的含量超過閾值（一般為75%）時才會觸發(fā)二級（圖4）。這樣使得母離子會盡可能在其色譜洗脫峰的頂端來進行二級質譜的采集，一來縮短離子注入的時間，加快掃描速度，二來通過減少干擾來獲得更為準確的定量數(shù)據(jù)。

圖4. Precursor Fit選項的工作流程示意圖（點擊查看大圖）

 

共流出肽段的干擾一般都來自于不同價態(tài)的肽段，而FAIMS Pro作為一個針對價態(tài)的在線分級手段毫無疑問可以緩解共流出肽段干擾這一問題。采用TMT11標的敲除了不同基因的酵母樣品進行測試，發(fā)現(xiàn)啟用了Turbo-TMT, Precursor Fit和FAIMS Pro選項后顯著提升了樣品的定量深度和準確性（圖5）。

圖5.Turbo-TMT, Precursor Fit和FAIMS Pro選項提升TMT定量的深度和準確性（點擊查看大圖）

 

 

本期新品連載介紹了 Orbitrap Exploris™ 480質譜儀的定性能力，F(xiàn)AIMS Pro可選組件以及對TMT定量的改進。

這就夠了嗎？不，Orbitrap Exploris™ 480帶來的驚喜遠不止于此！

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參考文獻：

 

1.Hebert, A.S., et al., Comprehensive Single-Shot Proteomics with FAIMS on a Hybrid Orbitrap Mass Spectrometer. Anal Chem, 2018. 90(15): p. 9529-9537.

2.Pfammatter, S., et al., A Novel Differential Ion Mobility Device Expands the Depth of Proteome Coverage and the Sensitivity of Multiplex Proteomic Measurements. Mol Cell Proteomics, 2018. 17(10): p. 2051-2067.

3.Bruderer, R., et al., Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues. Mol Cell Proteomics, 2015. 14(5): p. 1400-10.

4.Peterson, A.C., et al., Parallel reaction monitoring for high resolution and high mass accuracy quantitative, targeted proteomics. Mol Cell Proteomics, 2012. 11(11): p. 1475-88.

5.Meier, F., et al., BoxCar acquisition method enables single-shot proteomics at a depth of 10,000 proteins in 100 minutes. Nat Methods, 2018. 15(6): p. 440-448.

6.Gallien, S., S.Y. Kim, and B. Domon, Large-Scale Targeted Proteomics Using Internal Standard Triggered-Parallel Reaction Monitoring (IS-PRM). Mol Cell Proteomics, 2015. 14(6): p. 1630-44.