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氨基bi林-N-脫甲基酶（AND）試劑盒說(shuō)明書

分光光度法 50 管/24 樣

氨基bi林-N-脫甲基酶AND試劑盒P450

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

細(xì)胞色素P450 酶是一組在外源物質(zhì)代謝中，尤其是藥物和毒物，具有重要作用的酶系。AND 作為P450酶系的重要一員，相當(dāng)于CYP3A4 亞型，與藥物的去甲基化反應(yīng)密切相關(guān)。

測(cè)定原理：

AND 催化氨基bi林釋放甲醛，通過(guò) Nash 比色法測(cè)定甲醛含量，即可計(jì)算出 AND 活性。

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 50ml 蒸餾水充分溶解。

試劑三：粉劑×1 瓶（棕色瓶），4℃避光保存。臨用前加入 2.6ml 無(wú)水乙醇，充分溶解。試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 2.6ml 蒸餾水，充分溶解。

試劑五：粉劑×1 瓶，室溫保存。臨用前加蒸餾水 10ml 充分溶解。

標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1 瓶，-20℃保存。臨用前取 1.5ml EP 管，加入 10μl 標(biāo)準(zhǔn)液，加 990μl 蒸餾水，混勻即為0.05 mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)甲quan溶液，4℃保存。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1ml 玻璃比色皿、蒸餾水、無(wú)水乙醇和冰。

粗酶液提取：

1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約 0.5g 組織，加入 1ml 試劑一，冰上充分研磨，10000g 4℃

離心 30min，取上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。

2、粗制微粒體：4℃，10000g，離心 60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1ml 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，10000g 離心 30min，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5ml，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測(cè)。該待測(cè)液需當(dāng)天使用。

AND 活性測(cè)定操作：

分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 412 nm，蒸餾水調(diào)零。

試劑二置于 37℃水浴中預(yù)熱 30min。

對(duì)照管：取 1 支EP 管，加入 50μl 粗酶液，850μl 試劑二，50μl 試劑三，50μl 蒸餾水，混勻后置于37℃水浴保溫 30min；立即加入 175μl 試劑五，混勻后置于冰浴中 5min；取出后加入 175μl 試劑六，混勻后室溫靜置 5min；室溫 8000rpm 離心 5min；取新的 EP 管，加入 500μl 上清液，500μl 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷卻 5min，于 412nm 測(cè)定光吸收，記為 A 對(duì)照管。

測(cè)定管：取 1 支EP 管，加入 50μl 粗酶液，850μl 試劑二，50μl 試劑三，50μl 試劑四，混勻后置于37℃水浴保溫 30min；立即加入 175μl 試劑五，混勻后置于冰浴中 5min；取出后加入 175μl 試劑六，混勻后室溫靜置 5min；室溫 8000rpm 離心 5min；取 1 支新EP 管，加入 500μl 上清液，500μl 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷卻 5min，于 412nm 測(cè)定光吸收，記為A 測(cè)定管。

標(biāo)準(zhǔn)管：取 1 支EP 管，加入 500μl 標(biāo)準(zhǔn)品，500μl 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷卻 5min，于 412nm 測(cè)定光吸收，記為A 標(biāo)準(zhǔn)管。

注意：每個(gè)樣品都需要做對(duì)照管。

AND 活性計(jì)算：

按照蛋白濃度計(jì)算:

活性單位定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個(gè)酶活單位。

AND 活性(nmol/min/mg prot)= C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 45×（A 測(cè)定管－A 空白管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計(jì)算:

活性單位定義：37℃中每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個(gè)酶活單位。

AND 活性(nmol/min/g 鮮重)= C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(W×V樣)÷T

= 45×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 標(biāo)準(zhǔn)品：500μl=0.0005 L；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上清液=（50+850

+50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度mg/ml，需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；V 樣：加入粗酶液體積，50μl=0.05ml；W：樣本質(zhì)量，g ；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。

注意事項(xiàng)：

1、粗酶液需在當(dāng)日完成測(cè)定，如需保存，則向粗酶液提取步驟 3 的沉淀中加 0.5ml 20%的甘油，分裝后，

-80℃保存；

2、試劑三和試劑四需臨用前配制，如當(dāng)天沒(méi)有用完，4℃避光保存，可用 1 周；

3、粗酶液可直接用于蛋白濃度測(cè)定，建議用 BCA 法測(cè)蛋白含量。

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