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乙酰dan堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/48 樣

乙酰dan堿酯酶活性測(cè)定試劑盒

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

AchE 屬于絲an酸水解酶，廣泛存在于各種動(dòng)物組織和血清中。AchE 催化乙酰dan堿（Ach）水解，在神經(jīng)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)中起重要作用。

測(cè)定原理：

AchE 催化Ach 水解生成dan堿，dan堿與二硫?qū)ο趸郊姿?/span>（DTNB）作用生成 5-巰基-硝基苯甲酸（TNB）； TNB 在 412nm 處有吸收峰，通過(guò)測(cè)定 412 nm 吸光度增加速率，計(jì)算 AchE 活性。

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 2.6ml 試劑一，充分震蕩溶解。試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 2.6ml 試劑一，充分震蕩溶解。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，8000g 4℃離心 10min，取上清液待測(cè)。

細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g， 4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

血清等液體：直接測(cè)定。

測(cè)定操作：

分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 412 nm，蒸餾水調(diào)零。

試劑二置于 37℃水浴中預(yù)熱 30min。

取 1ml 玻璃比色皿，依次加入 100μl 上清液、800 μl 試劑一、50μl 試劑二和 50 μl 試劑三，迅速混勻，于 412nm 處測(cè)定 3min 內(nèi)吸光值變化，第 10s 吸光值記為A1，第 190s 吸光值記為A2?！鰽 測(cè)定管=A2-A1。

AchE 活性計(jì)算公式：

組織AchE 活性

按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

AchE 酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V 反總×109)÷（Cpr ×V 樣）÷T

= 245×△A÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

AchE 酶活(nmol/min/g 鮮重)= (△A÷ε÷d×V 反總×109)÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T

= 245×△A÷W

細(xì)菌、細(xì)胞AchE 活性

活性單位定義：每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

AchE 酶活(nmol/min/104 cell)= (△A÷ε÷d×V 反總×109)÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）÷T

= 245×△A÷細(xì)胞數(shù)量

血清AchE 活性

活性單位定義：每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

AchE 酶活(nmol/min /ml)= (△A÷ε÷d×V 反總×109)÷V 樣÷T

=245×△A

ε：TNB 摩爾消光系數(shù)，13.6×103 L/mol/cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），1 ml=0.001 L；106：1mol=1×106μmol； V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：蛋白濃度（mg/ml）；W：樣本質(zhì)量，g；V 樣：加入上清液體積（ml），

0.1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間（min），3 min。

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