一、試劑盒的組成與工作原理

試劑盒的組成

活細胞示蹤試劑盒（綠色熒光）主要包含一種或多種能夠與活細胞特異性結合的綠色熒光探針。這些探針通常是經過修飾的熒光染料或熒光蛋白，它們能夠通過特定的機制進入活細胞或與細胞膜上的特定成分結合。除了熒光探針外，試劑盒還可能包含用于調整細胞狀態(tài)和優(yōu)化染色效果的緩沖液和其他輔助試劑。

工作原理

綠色熒光探針通過與活細胞的特定成分結合，使活細胞發(fā)出明亮的綠色熒光。這些探針的設計使得它們能夠特異性地識別和標記活細胞，而不與死細胞或細胞外的物質發(fā)生反應。在熒光顯微鏡下，活細胞的綠色熒光清晰可見，從而實現(xiàn)對活細胞的實時追蹤和觀察。

二、操作使用方法

染色前準備

1. 細胞培養(yǎng)：根據(jù)實驗需求，將細胞培養(yǎng)至適宜的密度。對于貼壁細胞，可使用胰蛋白酶消化并收集細胞；對于懸浮細胞，直接收集即可。用PBS 洗滌細胞兩次，去除培養(yǎng)基和其他雜質。

2. 細胞計數(shù)與調整濃度：對收集到的細胞進行計數(shù)，并用適當?shù)木彌_液調整細胞濃度，一般建議的細胞濃度范圍為

   $1 \times 10^5 - 1 \times 10^6 \, \text{cells/mL}$

   ，以確保在后續(xù)的染色和檢測過程中能夠獲得理想的信號強度和細胞分布。

染色過程

1. 取適量細胞懸液：取適量的細胞懸液（通常為 100 μL），加入到新的離心管或培養(yǎng)皿中。

2. 加入染色試劑：按照試劑盒說明書的要求，加入適量的綠色熒光探針。一般情況下，每 100 μL 細胞懸液中需加入數(shù)微升的染料，具體用量應根據(jù)試劑盒的推薦進行調整。

3. 輕輕混勻：輕輕吹打或漩渦混勻細胞懸液，確保染料均勻分布并充分接觸細胞。這一步驟對于保證染色的均勻性和準確性至關重要。

4. 避光孵育：將染色后的細胞懸液置于適當?shù)臏囟龋ㄈ?37℃）下避光孵育一段時間，通常為 15 - 30 分鐘。避光孵育有助于防止染料的光漂白，確保熒光信號的穩(wěn)定和清晰。

染色后處理

1. 去除未結合的染料：用預冷的 PBS 或其他適當?shù)木彌_液洗滌細胞一次，以去除未結合的染料。離心速度為 300×g，離心時間為 5 分鐘。用適量的緩沖液重新懸浮細胞，以減少背景熒光并提高檢測的準確性。

2. 分析檢測：將染色后的細胞懸液轉移到流式細胞儀檢測管或熒光顯微鏡載玻片上，立即進行檢測。在熒光顯微鏡下，活細胞會發(fā)出明亮的綠色熒光，而死細胞則不會顯示熒光信號。這使得科研人員能夠清晰地區(qū)分活細胞和死細胞，并對活細胞進行動態(tài)觀察。

三、質量控制與注意事項

質量控制

活細胞示蹤試劑盒（綠色熒光）應保存在 4℃左右的低溫環(huán)境中，避免光照直射和溫度波動過大。在保存過程中，注意密封保存，防止試劑揮發(fā)或吸收水分。試劑盒在有效期內具有良好的穩(wěn)定性，每一批次都經過嚴格的質量檢測，確保其性能符合要求。

注意事項

在實驗過程中，需嚴格遵循無菌操作規(guī)范，避免細胞受到污染。使用的試劑、培養(yǎng)容器和操作工具都應經過嚴格的滅菌處理。實驗操作應在超凈工作臺中進行，以降低污染風險。

染色時間應根據(jù)細胞類型和實驗需求進行優(yōu)化。過短的染色時間可能導致染色不充分，影響檢測結果；過長的染色時間則可能導致非特異性染色，增加背景信號。建議在正式實驗前進行小規(guī)模的預實驗，以確定最佳的染色條件。

這兩種熒光染料對光敏感，操作過程中應盡量減少樣本的光照時間，以防止熒光淬滅。在染色和檢測過程中，應使用適當?shù)谋芄獯胧?，如使用避光罩或在暗室中操作。細胞狀態(tài)監(jiān)測：實驗全程觀察細胞狀態(tài)，確保良好生理狀態(tài)，異常時及時調整條件。