在細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中，細(xì)胞增殖和毒性檢測是評估細(xì)胞健康狀態(tài)、藥物效果及化學(xué)物質(zhì)生物活性的關(guān)鍵實驗技術(shù)。細(xì)胞增殖 / 毒性檢測試劑盒（CCK-8 法）憑借其簡便、靈敏、高效的特點，已成為科研工作者手中的得力工具。

一、CCK-8 法的原理

CCK-8 法的核心在于使用一種名為 WST-8 的高度水溶性四唑鹽。在具有活性的活細(xì)胞內(nèi)，WST-8 能夠在電子介體的協(xié)助下，被細(xì)胞中的脫氫酶還原生成橙色的水溶性甲瓚產(chǎn)物。這一反應(yīng)產(chǎn)生的顏色變化可以通過比色測定進(jìn)行量化，且生成的甲瓚產(chǎn)物量與活細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)?；谶@一原理，CCK-8 法能夠?qū)崿F(xiàn)對細(xì)胞增殖情況的精準(zhǔn)檢測和對細(xì)胞毒性實驗的靈敏評估。

二、CCK-8 法的優(yōu)勢

高靈敏度

CCK-8 試劑盒的檢測靈敏度高于其他常見的四唑鹽，例如 MTT、XTT、MTS 或 WST-1。這意味著在低細(xì)胞密度或細(xì)胞增殖緩慢的情況下，CCK-8 法仍能提供可靠的檢測結(jié)果。這使得研究人員能夠在更廣泛的實驗條件下進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性檢測，尤其適用于那些對靈敏度要求較高的實驗場景。

操作簡便

CCK-8 法的操作流程簡單快捷，無需復(fù)雜的設(shè)備或繁瑣的步驟。僅需將 CCK-8 溶液加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，經(jīng)過一定時間的孵育后，直接使用普通酶標(biāo)儀在 450 nm 波長處測量吸光度即可。這種簡便性使得實驗過程更加高效，減少了實驗操作時間和潛在的誤差來源。

水溶性與穩(wěn)定性

WST-8 的水溶性特性避免了傳統(tǒng)四唑鹽（如 MTT）在使用過程中產(chǎn)生的沉淀問題，使得反應(yīng)更加均勻，測量結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。同時，CCK-8 試劑盒的組分在常溫下相對穩(wěn)定，便于保存和反復(fù)使用。

非放射性

CCK-8 法是一種非放射性檢測方法，相較于放射性同位素標(biāo)記的檢測手段，它更加安全、環(huán)保，降低了實驗操作的風(fēng)險，并且減少了對特殊設(shè)備和許可的依賴。

三、CCK-8 法的操作步驟

細(xì)胞準(zhǔn)備

根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的細(xì)胞類型，并將其培養(yǎng)至適當(dāng)?shù)拿芏?。對于貼壁細(xì)胞，使用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞；對于懸浮細(xì)胞，直接收集即可。然后用相應(yīng)的培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?，通常為每毫?5×103 至 1×10? 個細(xì)胞。

染色過程

將細(xì)胞懸液接種于 96 孔板中，每孔 100 μL。設(shè)置空白孔（僅含培養(yǎng)基）、陰性對照孔（僅含細(xì)胞和培養(yǎng)基）和實驗孔（含細(xì)胞、培養(yǎng)基和待測藥物或刺激物）。每組設(shè)置至少三個復(fù)孔以確保數(shù)據(jù)的可靠性。將 96 孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃、5% CO?條件下孵育一段時間，使細(xì)胞貼壁或讓藥物作用于細(xì)胞。

加入 CCK-8 試劑

按照試劑盒說明書的要求，向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液。繼續(xù)將 96 孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 1 - 4 小時。孵育時間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型和實驗需求進(jìn)行優(yōu)化，以確保充分的反應(yīng)時間，使 WST-8 還原為甲瓚產(chǎn)物。

測量吸光度

孵育完成后，將 96 孔板置于酶標(biāo)儀上，使用 450 nm 波長測量各孔的吸光度值。若酶標(biāo)儀帶有 630 nm 的濾光片，可進(jìn)行雙波長測定，以扣除背景吸光度，提高檢測的準(zhǔn)確性。

四、CCK-8 法的應(yīng)用實例

藥物篩選與細(xì)胞毒性評估

CCK-8 法在藥物研發(fā)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用，可用于篩選和評估藥物的細(xì)胞毒性。通過將不同濃度的藥物與細(xì)胞共孵育，然后使用 CCK-8 法檢測細(xì)胞存活率，可以確定藥物的半數(shù)抑制濃度（IC??），從而評估藥物的潛在毒性和治療窗口。這為新藥研發(fā)過程中的藥物安全性評價提供了重要的數(shù)據(jù)支持。

細(xì)胞增殖研究

在細(xì)胞生物學(xué)研究中，CCK-8 法廣泛用于研究細(xì)胞的增殖特性。例如，通過檢測不同時間點細(xì)胞的 CCK-8 吸光度值，可以繪制細(xì)胞增殖曲線，了解細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下的生長動力學(xué)。這對于優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件、研究細(xì)胞周期調(diào)控以及探究細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有重要意義。

細(xì)胞凋亡與存活分析

除了增殖和毒性檢測，CCK-8 法還可以與其他檢測方法聯(lián)合使用，以獲得更全面的細(xì)胞狀態(tài)信息。例如，將 CCK-8 法與 Annexin V/PI 雙染法結(jié)合，可以同時檢測細(xì)胞的增殖情況和凋亡率，從而更準(zhǔn)確地評估細(xì)胞的生理狀態(tài)和實驗處理的影響。

五、注意事項與質(zhì)量控制

細(xì)胞狀態(tài)監(jiān)測

在實驗過程中，定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化，確保細(xì)胞處于良好的生理狀態(tài)。若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)異常，如形態(tài)改變、生長緩慢或顏色異常，應(yīng)及時調(diào)整實驗條件，可能是培養(yǎng)基營養(yǎng)不足、細(xì)胞受到污染或藥物濃度過高等原因?qū)е碌摹?/p>

避光操作

CCK-8 試劑和生成的甲瓚產(chǎn)物對光敏感，操作過程中應(yīng)盡量減少樣本的光照時間，以防止光漂白或光降解影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。在加入 CCK-8 試劑后，應(yīng)避免將 96 孔板暴露在強(qiáng)光下，并盡快進(jìn)行孵育和測量。

試劑質(zhì)量控制

確保所使用的 CCK-8 試劑盒質(zhì)量合格，保存條件符合要求。試劑盒應(yīng)保存在 4℃左右的低溫環(huán)境中，避免光照直射和溫度波動過大。在保存過程中，注意密封保存，防止試劑揮發(fā)或吸收水分。使用前應(yīng)仔細(xì)檢查試劑是否變色、沉淀或過期，如有異常則不宜使用。

實驗重復(fù)與數(shù)據(jù)驗證

為了確保實驗結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，建議進(jìn)行多次獨(dú)立實驗，并設(shè)置適當(dāng)?shù)闹貜?fù)孔數(shù)。對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和標(biāo)準(zhǔn)誤等指標(biāo)，以評估數(shù)據(jù)的離散性和顯著性。若實驗結(jié)果出現(xiàn)較大的變異系數(shù)或不符合預(yù)期，應(yīng)仔細(xì)檢查實驗操作過程，排除可能的誤差來源，重新進(jìn)行實驗。