一、乳酸脫氫酶法的原理

乳酸脫氫酶（LDH）是一種廣泛存在于各種細(xì)胞中的穩(wěn)定酶，正常情況下，細(xì)胞膜的完整性能夠防止 LDH 泄漏到細(xì)胞外。然而，當(dāng)細(xì)胞受到毒性物質(zhì)的損傷、發(fā)生凋亡或壞死導(dǎo)致細(xì)胞膜破損時，LDH 會迅速釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞毒性檢測試劑盒（乳酸脫氫酶法）正是基于這一原理，通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中 LDH 的活性來定量評估細(xì)胞膜損傷程度以及細(xì)胞毒性。

LDH 在細(xì)胞內(nèi)的濃度相對穩(wěn)定，且在細(xì)胞受損后釋放迅速，這使得它成為檢測細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡的理想標(biāo)志物。該方法具有高度的靈敏性和特異性，能夠準(zhǔn)確反映細(xì)胞受損的情況，且不受細(xì)胞種類和培養(yǎng)條件的顯著影響。

二、試劑盒的組成與操作流程

試劑盒的組成

細(xì)胞毒性檢測試劑盒（乳酸脫氫酶法）主要包含以下幾種關(guān)鍵組分：

• LDH 檢測試劑：含有特定的底物和輔助因子，能夠與 LDH 發(fā)生反應(yīng)，生成可檢測的產(chǎn)物。在反應(yīng)過程中，LDH 催化乳酸和 NAD? 氧化生成丙酮酸和 NADH，隨后通過一系列反應(yīng)生成可被比色或熒光檢測的產(chǎn)物。

• 反應(yīng)緩沖液：提供一個適宜的反應(yīng)環(huán)境，確保 LDH 酶活性的穩(wěn)定發(fā)揮，同時保證反應(yīng)的特異性和靈敏度。其成分經(jīng)過精心優(yōu)化，以消除其他因素對檢測結(jié)果的干擾。

操作流程

細(xì)胞培養(yǎng)與處理

根據(jù)實驗需求，將細(xì)胞接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)容器中，并進(jìn)行相應(yīng)的處理，如添加待測藥物、化學(xué)物質(zhì)或其他刺激因素。設(shè)置多個重復(fù)孔以提高實驗數(shù)據(jù)的可靠性。將培養(yǎng)容器置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在適宜的溫度（一般為 37℃）、濕度和二氧化碳濃度（通常為 5%）條件下孵育細(xì)胞，使細(xì)胞充分接觸處理因素并產(chǎn)生相應(yīng)的反應(yīng)。

收集培養(yǎng)上清液

孵育結(jié)束后，輕輕吸出培養(yǎng)孔中的上清液，注意避免對細(xì)胞造成機(jī)械損傷。將收集到的上清液置于冰上或 4℃保存，以防止 LDH 的降解或失活。上清液中釋放的 LDH 活性與細(xì)胞膜受損的細(xì)胞數(shù)量成正比，是評估細(xì)胞毒性的關(guān)鍵樣本。

加入檢測試劑并孵育

將收集到的上清液轉(zhuǎn)移至新的反應(yīng)孔中，按照試劑盒說明書的要求加入適量的 LDH 檢測試劑和反應(yīng)緩沖液。輕輕混勻后，在室溫下避光孵育一定時間，通常為 15 - 30 分鐘。孵育過程中，LDH 與檢測試劑發(fā)生反應(yīng)生成可檢測的產(chǎn)物。

比色測定與結(jié)果分析

使用酶標(biāo)儀在特定波長下（一般為 490 - 500 nm）測量反應(yīng)孔中的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或已知濃度的 LDH 樣品，計算出樣本中 LDH 的活性或濃度。LDH 活性越高，表明細(xì)胞膜受損的細(xì)胞數(shù)量越多，細(xì)胞毒性越強(qiáng)。通過比較處理組與對照組的 LDH 活性，可以定量評估待測物質(zhì)的細(xì)胞毒性。

三、應(yīng)用實例與優(yōu)勢

應(yīng)用實例

藥物毒性篩選

在藥物研發(fā)過程中，細(xì)胞毒性檢測試劑盒（乳酸脫氫酶法）被廣泛用于篩選化合物的細(xì)胞毒性。通過測定不同濃度藥物處理后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的 LDH 活性，可以確定藥物的半數(shù)抑制濃度（IC??），從而評估藥物的潛在毒性。這有助于在藥物研發(fā)的早期階段排除具有高毒性的候選化合物，提高藥物研發(fā)的成功率。

化學(xué)物質(zhì)毒性評估

對于環(huán)境化學(xué)物質(zhì)、食品添加劑等的毒性評估，該試劑盒提供了一種快速、靈敏的檢測手段。能夠快速評估這些化學(xué)物質(zhì)對細(xì)胞的潛在危害，為食品安全和環(huán)境保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

優(yōu)勢分析

• 靈敏度高：LDH 法對細(xì)胞毒性變化的檢測非常靈敏，能夠檢測到少量細(xì)胞受損釋放的 LDH，適用于各種細(xì)胞類型和不同毒性程度的檢測。即使是低水平的細(xì)胞膜損傷，也能通過 LDH 活性的變化準(zhǔn)確反映出來，這對于早期毒性評估和低毒性化合物的篩選具有重要意義。

• 特異性強(qiáng)：LDH 作為細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定酶，其釋放主要與細(xì)胞膜損傷相關(guān)，因此 LDH 法具有較高的特異性。與其他細(xì)胞毒性檢測方法（如基于代謝活性的 MTT 法）相比，LDH 法不受細(xì)胞代謝狀態(tài)變化的影響，能夠更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞膜的完整性損傷，避免了因細(xì)胞代謝差異導(dǎo)致的假陽性或假陰性結(jié)果。

• 操作簡便：該試劑盒的操作流程簡單易行，無需復(fù)雜的儀器設(shè)備和特殊的技術(shù)要求。僅需常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備和酶標(biāo)儀，即可完成從細(xì)胞處理到結(jié)果檢測的全過程。這使得該方法易于在不同實驗室之間推廣和應(yīng)用，特別適合高通量篩選和大規(guī)模實驗。

• 穩(wěn)定性好：LDH 在細(xì)胞培養(yǎng)基中相對穩(wěn)定，能夠在較長時間內(nèi)保持活性。這使得樣本的收集和檢測可以靈活安排，無需嚴(yán)格精確的時間控制，為實驗操作提供了更大的便利性。同時，試劑盒的組成成分穩(wěn)定性高，保存時間長，有利于實驗的連續(xù)開展和重復(fù)性驗證。

四、注意事項與質(zhì)量控制

注意事項

• 避免樣本污染：在操作過程中，應(yīng)嚴(yán)格遵循無菌操作原則，避免樣本受到微生物污染。污染可能會影響 LDH 的活性檢測結(jié)果，導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏差。使用無菌的試劑、耗材和培養(yǎng)容器，并在超凈工作臺中進(jìn)行操作。

• 控制實驗條件：實驗條件的一致性對于準(zhǔn)確評估細(xì)胞毒性至關(guān)重要。包括細(xì)胞密度、處理時間、溫度、濕度和二氧化碳濃度等，都應(yīng)保持穩(wěn)定。細(xì)胞密度過高或過低可能影響檢測靈敏度；處理時間的差異可能導(dǎo)致 LDH 釋放量的不同；溫度和氣體條件的變化會影響細(xì)胞的代謝和酶活性。

• 及時檢測：收集到的培養(yǎng)上清液應(yīng)盡快進(jìn)行檢測，以防止 LDH 的降解或失活。若不能立即檢測，應(yīng)將樣本置于冰上或 4℃短期保存（不超過 6 小時），對于長期保存（超過 6 小時），建議將樣本置于 -20℃或 -80℃冷凍保存，但需注意避免反復(fù)凍融，以免影響 LDH 活性。反復(fù)凍融會使 LDH 發(fā)生變性，導(dǎo)致活性降低，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

• 避免溶血和細(xì)胞碎片干擾：在收集培養(yǎng)上清液時，應(yīng)輕柔操作，避免劇烈振蕩或機(jī)械損傷細(xì)胞，以防溶血和細(xì)胞碎片釋放 LDH，從而干擾檢測結(jié)果。溶血會使大量 LDH 從紅細(xì)胞中釋放，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高；細(xì)胞碎片中的 LDH 也可能被誤判為細(xì)胞毒性釋放的 LDH，影響對實際細(xì)胞膜損傷程度的準(zhǔn)確評估。

質(zhì)量控制

• 設(shè)置對照：每次實驗都應(yīng)設(shè)置適當(dāng)?shù)膶φ战M，包括空白對照（僅含培養(yǎng)基）、陰性對照（未處理的正常細(xì)胞）和陽性對照（使用已知毒性物質(zhì)處理的細(xì)胞）。通過比較不同組別的 LDH 活性，可以驗證實驗的可靠性和準(zhǔn)確性，同時排除實驗中可能出現(xiàn)的非特異性干擾因素?？瞻讓φ沼糜谛?zhǔn)酶標(biāo)儀的背景吸光度；陰性對照反映正常細(xì)胞的 LDH 本底水平；陽性對照用于評估實驗系統(tǒng)的靈敏度和檢測限。

• 重復(fù)實驗：為了確保數(shù)據(jù)的可靠性，建議進(jìn)行多次獨立重復(fù)實驗。統(tǒng)計學(xué)分析可幫助評估數(shù)據(jù)的離散性和變異性，如計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、標(biāo)準(zhǔn)誤以及進(jìn)行 t 檢驗等。多次重復(fù)實驗的結(jié)果一致性高，表明實驗數(shù)據(jù)具有較高的可信度。

• 使用標(biāo)準(zhǔn)品：試劑盒通常提供 LDH 標(biāo)準(zhǔn)品，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。在每次實驗中，應(yīng)同時測定標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可以準(zhǔn)確計算樣本中 LDH 的活性或濃度，消除實驗間差異和試劑批次間的影響，確保不同實驗結(jié)果之間的可比性。