糖基化對蛋白藥物的療效，穩(wěn)定性，免疫 原性具有重要點影響。以單克隆抗體為例， 常見的N-糖型主要為G0F、G1F、G2F、G1FGlcNAc、G0F-GlcNAc等；如果出現OligoMan、 Gal-a-1,3-Gal、NGNA、Xyl-1,2 Fuc-1,3等糖型， 則會影響免疫原性或半衰期，需要避免；另 一方面，可以細胞工程及分子生物學技術， 提高A-Fuc，GlcNAc bisecting，G2F， Hyper Sialyation(NANA)的含量，以增強ADCC，CDC， Anti-inflammatory 等效能。寡糖為非模板合成， 并呈樹狀結構，其結構極其復雜，僅由6種單 糖組成的寡糖鏈，其理論結構即達到驚人的 1012種。這就要求用于寡糖的分析設備具有強 悍的分析性能。Thermo Fisher開發(fā)了一系列簡單、的液相色譜-質譜表征方法，涵蓋 了從糖鏈結構分析、到糖基化位點鑒定、再 到糖肽解析的完整分析流程（圖2）。

一、寡糖鏈分析 N-糖鏈（由天冬酰胺連接寡糖）結構分析 包括寡糖鏈釋放、標記、液質聯(lián)用分析和數 據處理四個步驟（圖2）[1] 。寡糖鏈釋放根據 不同的糖基化類型選擇不同的方法，N-糖鏈主 要使用PNGase F。衍生化標記步驟可以增強寡 糖的質譜響應。其中，還原末端標記2-AB等苯 胺或雜環(huán)化合物還可使寡糖鏈通過熒光檢測， 全甲基化標記增強寡糖鏈的疏水性，實現反 相分離檢測。以Q-Exactive為代表的Orbitrap超

高分辨質譜具有高的靈敏度優(yōu)勢，使用其直 接分析未標記的糖鏈也可以取得滿意的效果。 寡糖碎片質譜可使用SimGlycanTM軟件進行全 自動結構解析，獲得寡糖鏈精細結構信息。在寡糖色譜分析中，專門為寡糖分離設計 的GlycanPac AXH-1/AXR-1色譜柱，結合了弱陰 離子交換WAX和親水相互作用HILIC (AXH-1)/反 相RP (AXR-1)兩種保留機理，能夠率地分 析復雜寡糖鏈混合樣本。經典的HILIC/RP機理 可以根據電荷數、極性、大小實現寡糖鏈分 離，而WAX機理保留和選擇帶負電荷的寡糖 鏈，對含唾液酸的寡糖鏈具有很好的分離效 果。使用GlycanPac色譜柱分析2-AB標記的牛 胎球蛋白(Bovine Fetuin) N-糖鏈，結果表明寡 糖鏈得到有效分離，特別是對含有唾液酸的寡糖的分離效果良好（圖3A）。即使分析未 標記的天然牛胎球蛋白N-糖鏈（圖3B），仍 然獲得了理想的分離效果[2,3] 。

以 Q-Exactive 為代表的靜電場軌道阱 Orbitrap具有10萬以上的超高分辨率和amol級 的超高靈敏度，結合高能碎裂(HCD)模式，能 獲得豐富的碎片信息，并分辨和檢測寡 糖。通過牛胎球蛋白三天線復雜型N-糖鏈的二 級質譜分析（圖4A）可以看出，即使是寡糖鏈沒有被標記，譜圖仍然獲得了豐富的高強 度碎片信號，特別是B/Y、C/Z等跨環(huán)斷裂信息， 對寡糖鏈精細結構的解析具有重要作用。實 驗在牛胎球蛋白中成功解析了29種不同結構 的N-糖鏈（圖4B），其中絕大部分為含唾液 酸的寡糖鏈，證明UHPLC-Orbitrap對復雜寡糖 鏈的強大分析能力 [4] 。 GlycanPac 色譜與 Orbitrap結合還實現了僅糖苷鍵/構象不同的同

專業(yè)糖鏈結構解析軟件SimGlycanTM可實現 對復雜寡糖鏈譜圖的全自動解析。將實驗獲 得的寡糖鏈數據與內置數據庫中寡糖鏈的理 論碎片譜圖匹配，分別獲得糖苷鍵斷裂、雙 糖苷鍵斷裂、跨環(huán)斷裂、跨環(huán)斷裂+糖苷鍵斷 裂的匹配率（圖6），進而計算得到寡糖鏈的 結構解析結果[6] 。此外，還可以利用線性離子阱質量分析器 的多級功能(MSn)，對同分異構寡糖鏈進行多級碎裂和檢測，獲得單糖構象、糖苷鍵連接 等精細結構的更多差異信息，從多角度實現 同分異構寡糖鏈的結構解析和分辨[7] 。

二、糖基化位點分析 N-糖基化位點鑒定通常使用PNGase F 酶釋 放糖鏈，使肽段上產生去糖基化位點，并在 肽段上產生去糖基化痕跡：天冬酰胺(N)發(fā)生 脫氨基化，造成0.9840 Da的質量增加。通過 質譜尋找發(fā)生+0.9840 Da的天冬酰胺，以及N- 糖基化保守序列NXS/T (X代表脯氨酸以外的任 何氨基酸)過濾，獲得可信的鑒定結果（圖8）。 為了避免天然脫氨基化造成的假陽性，可以在18O水中進行酶切，使去糖基化位點含有一 個18O，形成+2.9890Da，可與天然脫氨基區(qū)分。

糖基化位點的發(fā)現與確證對質譜的分辨 率與靈敏度具有較高要求。Orbitrap由于具有 超高分辨率和超高靈敏度，無論對于單抗等 純蛋白樣品、還是全細胞蛋白等復雜樣品， 都是是糖基化位點表征的工具。目前糖 基化位點大的數據集，共從小鼠組織與血 漿中注釋了6367個糖基化位點[8] 。該實驗采用 用PNGase F 釋放糖鏈并標記18O方法，使用 Orbitrap鑒定糖基化位點，共鑒定到6367個位點，其中5753個位點是沒有記載的新位點。 該研究對糖蛋白的研究具有重要意義（圖9）， 也展示出了Orbitrap超群的性能。在相對簡單 的抗體及其他蛋白藥物糖基化位點表征中， Orbitrap更可毫無疑問地勝任此工作[9] 。

三、糖肽分析 糖肽分析前處理簡單，能同時鑒定糖基化 位點和解析寡糖鏈結構，并獲得位點特異性 糖鏈信息，即微觀不均一性。但是糖肽解析 比糖鏈與糖肽分開解析的傳統(tǒng)方法更為復雜： 寡糖鏈離子化效率較低；相比肽段骨架更易 碎裂，造成肽段骨架難以充分碎裂；譜圖非 常復雜，傳統(tǒng)搜庫手段。HCD高能碎 裂相比傳統(tǒng)CID能獲得更豐富的碎片信息，使 糖肽的寡糖鏈和肽段骨架充分碎裂。Orbitrap

超高分辨質量分析器能有效分辨糖肽產生的 復雜碎片，避免碎片離子間的相互干擾，提 高離子化效率較低的寡糖碎片響應。ByonicTM 可以實現復雜糖肽譜圖的全自動數據處理， 解析肽段骨架序列和寡糖鏈結構。

單抗藥物利妥昔(Rituximab)經Trypsin酶切 后，使用Q-Exactive在線分析，碎裂模式為 HCD，并使用ByonicTM解析譜圖。圖10展示了 糖肽EEQYNSTYR的譜圖解析結果，譜圖中存在 著豐富的糖肽碎片離子，并獲得超高質量精 度的可靠匹配，確定糖鏈結構為G0F。特別是 低分子量端的單糖和寡糖碎片，能夠作為診 斷離子，進一步確證糖肽解析結果[10,11] 。

融合蛋白藥物通常為糖蛋白，其糖基化 比單抗更為復雜。單抗寡糖鏈結構已研究的 較為透徹，但融合蛋白存在諸多未知寡糖鏈，這類糖肽的解析普通液質難以勝任。Orbitrap 超高分辨率、超高質量精度和靈敏度為未知 糖肽解析提供了有效解決方案。實驗使用 Orbitrap對高度糖基化的一種Fc融合蛋白藥物 進行了完整糖肽解析。該融合蛋白同時含有 多個N-糖和O-糖位點，寡糖鏈結構未知。以糖 肽TKPREEQYNSTYR解析結果為例（圖11）， HCD譜圖同時獲得了豐富的寡糖鏈碎片和肽段 骨架碎片，使用ByonicTM得到可靠鑒定結果 （圖11A）。由于寡糖鏈存在諸多同分異構體， 因此實驗進一步使用了SimGlycanTM確證寡糖 鏈結構，該寡糖鏈結構確證為三鏈高甘露糖 型 （ 圖 11B ） 。 解析結果匯總表明 ， 僅 TKPREEQYNSTYR上N317一個位點，就有15種 結構各異的寡糖鏈（圖11C）。實驗共獲得2 個N-糖基化位點、16個O-糖基化位點，83種 位點特異的寡糖鏈結構，為該融合蛋白的研 究和申報提供了重要表征信息[12] 。

Orbitrap質量分析器與HCD高能碎裂能有 效應對復雜未知糖肽解析的挑戰(zhàn)。對于一些 仍無法解析的情況，還可以利用多級裂 解MSn獲得寡糖鏈精細結構，或通過電子傳遞 裂解ETD得到更多肽段骨架碎裂，獲得與HCD 互補的結構信息[12-16] 。

四、ETD與O-Linked糖肽分析 O-Linked糖基化，主要發(fā)生在絲氨酸（S） 與蘇氨酸（T）殘基。在對O-Linked糖基化進 行位點分析時，會遇到較N-Linked糖基化更大 的困難。一方面，O-Linked糖基化分析中，缺 乏像N-Linked糖基化分析里使用的PNGases F糖

苷酶，而難以進行去糖基化位點質量標記。 另一方面。在多肽序列中，S與T經常密集出現， 如果使用常規(guī)的碰撞誘導解離（CID）方法， 糖苷鍵將成為主要的斷裂碎片，因此難于獲 得豐富的肽段碎片信息，導致序列及O-Linked 糖基化位點分析困難。因此O-Linked糖基化分 析需要使用到ETD（電子傳遞解離）技術。ETD優(yōu)先斷裂肽段骨架，避免了寡糖鏈的碎裂， 能為O-糖肽提供有效信息。通過ETD分析人血 清富組氨酸糖蛋白（HRG）T271-284肽段的兩 種不同寡糖鏈結構的O-糖肽，獲得了豐富的 肽段骨架碎片信息（c/z系列離子），而寡糖 鏈得以有效保留，降低了譜圖復雜性，有利 于糖基化位點與結構解析（圖12）[17] 。

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