二硫鍵對于穩(wěn)定蛋白質(zhì)藥物的空間結(jié)構(gòu)， 保持其活性具有重大的作用。而在蛋白質(zhì)藥 物的生產(chǎn)過程中，由于成本控制的需求，往 往追求較大的蛋白質(zhì)表達濃度，而使發(fā)生二 硫鍵錯配(disulfide scramble)的可能性有所上 升[1] 。因此，二硫鍵的連接確證成為蛋白質(zhì)藥 物質(zhì)量表征的必須環(huán)節(jié)。相對于對角線電泳 法、突變分析法、部分還原測序法，以及X晶 體衍射和核磁共振等技術(shù)，串聯(lián)質(zhì)譜在靈敏 度、準(zhǔn)確性、操作性等多方面*優(yōu)勢，已 經(jīng)成為二硫鍵表征的主流方法[2] 。早期的二硫 鍵液質(zhì)分析，采用人工對比還原與非還原肽 圖數(shù)據(jù)策略（圖1），來確定二硫鍵。這種策 略的靈敏度差、分析通量低、不同分析人員 造成的分析結(jié)果差異較大。近年隨著質(zhì)譜及 軟件技術(shù)的迅猛發(fā)展，目前二硫鍵分析工作， 已經(jīng)進入了直接分析階段，也就是直接采集 非還原蛋白質(zhì)藥物肽圖串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并通 過化軟件自動化查找二硫鍵。

在二硫鍵的質(zhì)譜分析中，碰撞誘導(dǎo)解離 （CID）與高能碰撞解離（HCD）是普遍的二級碎裂方法。使用HCD/CID作為采集二硫鍵 數(shù)據(jù)的優(yōu)點主要有：碎片信號較豐富，且強 度較均勻，采集頻率快，以及儀器價格經(jīng)濟。 圖2為鏈間、鏈內(nèi)以及復(fù)合型二硫鍵連接肽段 的二級碎片圖譜示例[3] 。

蛋白質(zhì)藥物二硫鍵分析主要有兩種需求， 分別是1）對期望二硫鍵連接的驗證；2）對 未知（錯配）二硫鍵的發(fā)現(xiàn)。在針對種 需求進行分析時，一般會將預(yù)期的二硫鍵連 接方式輸入軟件。分析軟件僅是在提供的連 接方式中尋找是否有匹配的質(zhì)譜信號。第二 種需求則是在僅提供蛋白氨基酸序列的情況 下，對未知（錯配）二硫鍵進行發(fā)現(xiàn)鑒定。 由于蛋白質(zhì)中存在眾多的半胱氨酸，而任意 兩個半胱氨酸都存在形成二硫鍵的可能性， 加之考慮到可能存在的非特異性酶切以及可 變修飾等因素，致使各種連接可能性的數(shù)目 以組合爆炸的規(guī)模出現(xiàn)。面對這種嚴(yán)酷的分 析要求，軟件需具有*大的數(shù)據(jù)處理性能。

軟件已經(jīng)成為二硫鍵分析的關(guān)鍵一環(huán)。其中專門針對Orbitrap系列質(zhì)譜碎裂特點所設(shè)計 的軟件種類多，如pLinks[3,4] 、StavroX[5] 等， 這也從一個側(cè)面說明了Orbitrap型質(zhì)譜在二硫 鍵分析中已被為廣泛地應(yīng)用。在這些軟件 中，較為出色的如pLinks具有了令人振奮的數(shù) 據(jù)分析性能。在進行錯配二硫鍵發(fā)現(xiàn)時， pLinks可在考慮肽段N、C兩端都為非特異性酶 切，并含可變修飾條件下，在幾分鐘內(nèi)就可 完成二硫鍵數(shù)據(jù)檢索。Thermo 新近推出的 PepFinder作為整合的生物制藥軟件分析平臺， 同樣具備了未知二硫鍵檢索功能，為分析人 員的工作提供了極大的便利。

需要指出的是，二硫鍵分析實驗由于需要 在不*對蛋白質(zhì)進行變性（不還原二硫鍵） 的情況下進行，酶切相對普通肽圖分析（蛋 白質(zhì)被充分變性后酶切），較難一次得到理 想的酶切效果，因此在樣品處理方面，需要 根據(jù)不同的樣品，摸索和優(yōu)化樣品處理方法。 考慮的因素包括：酶切的時間、多酶酶切選 擇[6] ，減少堿性環(huán)境、封閉自由半胱氨酸以避 免引入錯配二硫鍵等等 [3,7] 。這些都是在實驗 設(shè)計及結(jié)果分析中需要特別注意的方面。

此外，二硫鍵分析還具有一般肽圖分析不 具有的復(fù)雜性，如：鏈內(nèi)二硫鍵[8] 、多對以上 二硫鍵結(jié)構(gòu) （ 如 cystine Knot and nested disulfide）[6] 、糖肽形與二硫鍵同時存在[9] 、通 過二硫鍵形成的環(huán)肽[10] 等。在這些情況下， 單純使用一種碎裂方法所獲得的信息有限， 因此ETD與MSn等質(zhì)譜技術(shù)就成為了CID/HCD技 術(shù)的有效補充。

ETD技術(shù)作為與CID/HCD并列的多肽碎裂 技術(shù)，其碎片特性與后兩者有著明顯的不同。 在二硫鍵碎裂方面，明顯的差異就是， CID/HCD無法打開二硫鍵，以及含鏈內(nèi)二硫肽 段在兩個半胱氨酸之間的序列區(qū)域無法產(chǎn)生碎片。而ETD在這兩種情況下都可以產(chǎn)生碎片 [11] 。如圖X。顯而易見，ETD與CID/HCD產(chǎn)生的 碎片信息互補性*，綜合使用將非常有利 于終得到可信的結(jié)果[7] 。

多級質(zhì)譜也是針對復(fù)雜二硫鍵分析時可以 選擇的一種方法。Wu等使用ETD對含二硫鍵 肽段進行二級碎裂后，根據(jù)其碎片特點進行 CID-MS3碎片采集（圖4），得到了更豐富的碎 片信息，這種方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種蛋白 質(zhì)藥物產(chǎn)品的分析中[7，12] 。

在ETD與MSn聯(lián)用的方法中，對于一級質(zhì) 譜中發(fā)現(xiàn)的母離子，平行進行CID與ETD二級 信息采集。通過兩種碎裂方式產(chǎn)生碎片互補 性，可得到更為充分的序列信息。此外，對于鏈間二硫鍵，由于ETD自身特點，在ETD的 二級碎片中，常常會出現(xiàn)兩種強信號。 種強信號是由單純的二硫鍵斷裂（兩條肽段 分離，但都各自保持完整，表示為Pep1和 Pep2）產(chǎn)生的。在這種情況下，可以分別針 對Pep1和Pep2采集三級CID碎片。這樣就可以 分別得到兩個肽段各自清晰的碎片信息。顯 而易見，相對于兩種肽段混在一起的MS2碎片， MS3碎片信息更具針對性，從而大大提高了其 鑒定可信度，與碎片覆蓋度。二級ETD經(jīng)常產(chǎn) 生的另一種強信號，表面上看是一級母離子 減少電荷的形式。而其中實際包含了1）已發(fā) 生碎裂，但Pep1與Pep2仍通過非共價鍵粘附 在一起的形式，以及2)真正的單純減少電荷離 子形式。對于后者，可以通過增加活化能以 及MS3、MS4等方法，進一步挖掘序列信息。

串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)藥物二硫 鍵分析重要的手段。在Orbitrap及離子阱質(zhì) 譜高質(zhì)量的數(shù)據(jù)條件下，加之軟件技術(shù)的巨大發(fā)展，使得二硫鍵檢索分析實現(xiàn)了快速、 準(zhǔn)確、高通量的要求，從而使二硫鍵分析進 入了常規(guī)化分析時代。

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