活細胞表面受體二聚化/寡聚化分析

時間：2010/12/2閱讀：3213

摘要： 目前有兩個不同的方向進行受體二聚化/寡聚化檢測，一個是體外檢測，一個是活細胞檢測。CO-IP是應用zui廣泛的檢測二聚化/寡聚化的體外方法?；罴毎麢z測的方法主要基于能量共振轉(zhuǎn)移原理，包括FRET、pbFRET 、BRET、HTRF（TR-FRET）等。Tag-lite將SNAP-Tag、HaloTag和HTRF技術結合起來，可以非常方便可靠地檢測活細胞受體二聚化/寡聚化。

G蛋白偶聯(lián)受體很久以來一直被認為是以單體的形式存在，并且與配體結合進行信號轉(zhuǎn)導的。然而，近年來，越來越多的實驗證據(jù)表明，有的GPCR可形成同源二聚體或異源二聚體而發(fā)揮作用。雖然這種聚集在與G蛋白結合方面的作用還存在爭議，但是許多GPCR確實可形成二聚體/寡聚體是毋庸置疑的，尤其是C類受體（class C receptor）。二聚體/寡聚體除了可能參與G蛋白結合，還可能在GPCR脫敏、GPCR合成后從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌到細胞表面等過程中發(fā)揮作用。

二聚化/寡聚化的發(fā)現(xiàn)給新藥研發(fā)提供了新的思路，尤其是對于異源聚集。在這種模式下，藥物可能與一個GPCR結合，并共同活化了第二個GPCR，引起細胞反應。如果我們只用其中一個GPCR去做篩選，很可能看不到有意義的結果。同時，受體聚集的提出，給孤兒受體（orphan GPCR）也提出了新的解釋?；蛟S，這些孤兒受體可與其它GPCR形成二聚體/寡聚體，作為parter，而不是以單體的形式發(fā)揮作用。

有兩個不同的方向進行受體二聚化/寡聚化檢測，一個是體外檢測，一個是活細胞檢測。CO-IP是應用zui廣泛的檢測二聚化/寡聚化的體外方法?；罴毎麢z測的方法主要基于能量共振轉(zhuǎn)移（RET）原理，包括FRET、pbFRET 、BRET、HTRF（TR-FRET）等。Tag-lite將SNAP-Tag、HaloTag和HTRF技術結合起來，可以非常方便可靠地檢測活細胞受體二聚化/寡聚化。

檢測原理

同源二聚體的檢測
構建SNAP和GPCR的共表達載體，轉(zhuǎn)染入細胞，可表達SNAP-GPCR的融合蛋白。然后，加入分別標記了Tb和Acceptor熒光染料的底物，則部分GPCR標記了Tb（Tb-GPCR），部分標記了Acceptor熒光染料（Acceotor-GPCR）。如果GPCR可以形成同源二聚體，配體刺激后，兩個GPCR會相互靠近并偶聯(lián)。Tb-GPCR與Acceptor-GPCR之間發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，檢測到HTRF信號，見圖1。

圖1：GPCR同源二聚體檢測模式

異源二聚體的檢測
分別構建SNAP-GPCR1和CLIP-GPCR2的表達載體，共轉(zhuǎn)染，可得到表達SNAP-GPCR1和CLIP-GPCR2的細胞。加入標記了Tb的SNAP底物和標記了Acceptor熒光染料的CLIP底物，細胞表面的受體為Tb-SNAP-GPCR1和Acceptor-CLIP-GPCR2。如果GPCR形成異源二聚體，配體刺激后，GPCR1/2相互靠近發(fā)揮作用。Tb與Acceptor之間發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，檢測到HTRF信號，見圖2。

圖2：GPCR異源二聚體檢測模式

HaloTag與SNAP相似，也是一個自身標記的酶，通過與標記了熒光的底物反應，將自身標記上熒光。在這個實驗中，我們也可以構建HaloTag與GPCR的表達載體。

檢測特點和優(yōu)勢
• 活細胞水平的檢測
• 檢測背景低：時間分辨熒光的檢測方式，沒有熒光染料自身的交叉干擾和來自樣品自發(fā)熒光的干擾
• 實驗結果可靠：FRET技術使檢測結果反映的是真正的受體聚集，而不是僅僅相互靠近
• 不需要抗體：Tag-lite利用的SNAP技術，不需要抗體來確定實驗的特異性

應用領域
• 受體二聚化/寡聚化分析
• 孤兒受體的研究

應用實例

C類GPCR：GPCRGABAB1與GABAB2的異源二聚化檢測
分別構建GABAB1與SNAP-Tag和GABAB2與HaloTag的表達載體，共轉(zhuǎn)染細胞。蛋白表達后，固定SNAP的底物BG-Tb濃度不變，配制不同濃度的HaloTag的底物Halo-Red濃度，將兩種底物混合后加入細胞。孵育1h后，檢測HTRF信號，實驗結果如圖3所示。

GABAB1與GABAB2形成異源二聚體發(fā)揮作用。隨著Halo-Red濃度的加大，有更多的能量從Tb轉(zhuǎn)移到Red染料上，HTRF信號增強，直到達到平衡。

圖3：GABAB1與GABAB2的異源二聚化檢測

A類GPCR：多巴胺D2與Delta 阿片的異源二聚化檢測
分別構建Delta阿片與SNAP-Tag和多巴胺與HaloTag的表達載體，共轉(zhuǎn)染細胞。蛋白表達后，固定SNAP的底物BG-Tb濃度不變，配制不同濃度的HaloTag的底物Halo-Red濃度，將兩種底物混合后加入細胞。孵育1h后，檢測HTRF信號，實驗結果如圖4所示。

圖4：GABAB1與GABAB2的異源二聚化檢測

多巴胺D2與Delta阿片形成異源二聚體發(fā)揮作用。隨著Halo-Red濃度的加大，有更多的能量從Tb轉(zhuǎn)移到Red染料上，HTRF信號增強，直到達到平衡。

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