如何用間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞

如何用間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞
 

間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，貨號NC0103，英文名稱：Mesenchymal Stem Cell Serum-free Medium。

【間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基   用途與描述】
間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基可用于多種來源的人類間充質(zhì)干細(xì)胞的原代細(xì)胞分離及細(xì)胞傳代，同時(shí)還能保持其多向分化的潛能，如骨髓（BM-hMSC)、脂肪組織（AT-hMSC）、臍帶（UCM-hMSC）。使用本產(chǎn)品無需添加血清或血清替代物。
間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基化學(xué)成分明確、無血清、無動(dòng)物源成分。產(chǎn)品批間差異小，所有原料符合GMP標(biāo)準(zhǔn)。更適合臨床研究用途。

【間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基   規(guī)格與保存】

* 胰蛋白酶抑制劑，并不用于間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)。僅單獨(dú)用于細(xì)胞消化時(shí)終止細(xì)胞消化進(jìn)程。
由于間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中沒有添加胰酶抑制劑，因此不可用間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基終止細(xì)胞消化。僅可用胰蛋白酶抑制劑終止細(xì)胞消化。

【間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基   使用方法】

1. 間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)基準(zhǔn)備

將間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基添加劑在2-8℃過夜融化，按1:100比例加入培養(yǎng)基基礎(chǔ)中即成為間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)基。

特別提醒：間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)基2-8℃避光可保存30天。
科研用途小量、多次使用，建議采用分裝培養(yǎng)基添加劑后以-20℃保存的形式，可避免培養(yǎng)基的浪費(fèi)。

2. 間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇（以T-75瓶為例）

1)從冰箱中取出*培養(yǎng)基，在生物安全柜或超凈臺中吸取適量（如T-75瓶：10-15mL)*培養(yǎng)基沿上表面加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，
切勿沖到培養(yǎng)瓶底面（細(xì)胞生長面）。然后慢慢將培養(yǎng)瓶放平，在生物安全柜或超凈臺中室溫放置5-10分鐘后使用。

特別提醒：請嚴(yán)格按照此步驟操作，否則可能會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長空白區(qū)域，即所謂的“生長空洞”。原因是多數(shù)用戶使用的不是
的預(yù)包被培養(yǎng)瓶，而是普通的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，其表面并不適合無血清培養(yǎng)環(huán)境下的MSC的貼壁。室溫放置10分鐘，可讓培養(yǎng)基
中的促貼壁物質(zhì)更好的結(jié)合在培養(yǎng)瓶底部，MSC細(xì)胞的貼壁能力更強(qiáng)，不會(huì)出現(xiàn)“生長空洞”。

2) 從液氮中取出凍存的間充質(zhì)干細(xì)胞，迅速將凍存管放入37℃水浴快速融解。

3) 在生物安全柜或超凈臺中，將解凍后的細(xì)胞懸液緩慢加入5-10 mL 預(yù)溫的*培養(yǎng)基中。

4) 1000 rpm 離心3 min，棄上清，加入2 mL*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，按密度2x10⁴ cells/cm² 將細(xì)胞接種至1)步驟中
孵育完的培養(yǎng)瓶中，添加時(shí)，將培養(yǎng)瓶立起來，細(xì)胞懸液直接加到底部，切忌沖到培養(yǎng)瓶底面。

5) 混勻后，將培養(yǎng)瓶置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃，5%CO2 。 

6) 24 h后，更換新鮮的、預(yù)溫的*培養(yǎng)基。 

3. 間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)（以T-75瓶為例）

1) 在顯微鏡下觀察間充質(zhì)干細(xì)胞 ，當(dāng)間充質(zhì)干細(xì)胞融合度達(dá)到90%，即可傳代。

特別提醒：細(xì)胞融合度請勿超過90%。很多傳代后的細(xì)胞大比例死亡，是由于傳代前細(xì)胞生長過密（融合度過高），導(dǎo)致細(xì)胞消化異常
（細(xì)胞整片或成片脫落），加之隨后的不當(dāng)操作（如用移液器反復(fù)吹打成片細(xì)胞使其成為單個(gè)細(xì)胞），此機(jī)械損失過程會(huì)嚴(yán)重?fù)p害細(xì)胞
膜，引發(fā)大比例的細(xì)胞死亡，特別是MSC細(xì)胞經(jīng)凍存后再次使用時(shí)。

2) 預(yù)處理培養(yǎng)瓶，處理方法同細(xì)胞復(fù)蘇中的1)步驟。

3) 在超凈臺中，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入5-10 mL PBS清洗細(xì)胞后棄去（此步可選，目的是去除變圓脫落的死細(xì)胞），再加入2 mL
 0.05%胰酶-EDTA 或無動(dòng)物源基因重組胰酶（貨號NC1002）消化細(xì)胞。

4) 在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓時(shí)，立即加入5 mL 胰酶抑制劑（配套產(chǎn)品，貨號NC1003）終止消化。

5) 用移液器輕輕吹打瓶壁上未*脫離的細(xì)胞，并輕輕吹打混勻，使細(xì)胞*分散。

6) 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL 離心管中，1000 rpm離心3 min。棄上清，加入2 mL*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，按細(xì)胞密度
2x10⁴cells/cm² ，將細(xì)胞接種至細(xì)胞傳代 2)步驟中孵育完的培養(yǎng)瓶中，添加時(shí)，將培養(yǎng)瓶立起來，直接加到底部，切忌沖到培養(yǎng)瓶底面。

7) 將培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO₂ 條件下培養(yǎng)。 

4. 間充質(zhì)干細(xì)胞凍存

1) 用0.05%胰酶消化待凍存的間充質(zhì)干細(xì)胞，加入胰酶抑制劑（貨號NC1003）終止消化并離心，重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2) 1000 prm 離心3 min，去除上清。

3) 根據(jù)計(jì)數(shù)情況，緩慢加入適量冷的無血清凍存液（無血清凍存液可即拿即用或置于冰袋備用），調(diào)整細(xì)胞密度在1x10⁶ cells/mL左右。

4) 輕輕地重懸細(xì)胞，將重懸均勻的細(xì)胞按等份加入到滅菌的凍存管（需提前做好標(biāo)記）中，旋緊凍存管蓋 。

5) 迅速將凍存管放入程序降溫盒中，然后將凍存盒直接放入-80℃冰箱。
注：如果使用Yocon無血清細(xì)胞凍存液(貨號 NC1001），則不需要程序降溫步驟，可直接將細(xì)胞放于-80℃冰箱。

6) 12 h后將細(xì)胞從-80℃冰箱轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存。
 

友康生物第3代間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基面向的目標(biāo)群體是從事干細(xì)胞存儲、干細(xì)胞臨床應(yīng)用及干細(xì)胞研發(fā)領(lǐng)域的專業(yè)用戶。該產(chǎn)品創(chuàng)新性的特點(diǎn)是：用2代的價(jià)格向市場提供了3代的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基產(chǎn)品。