NIH-3T3細(xì)胞|NIH-3T3-LUC小鼠成纖維熒光素酶標(biāo)記

上海琛藝實(shí)業(yè)有限公司經(jīng)過數(shù)年的努力發(fā)展已迅速成為集產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)為一體的專業(yè)化生物工程公司。公司新引進(jìn)細(xì)胞上千株，其中人的已通過STR鑒定的有幾百株，歡迎各位選購。。。。。。

產(chǎn)品名稱：NIH-3T3細(xì)胞|NIH-3T3-LUC小鼠成纖維熒光素酶標(biāo)記

包裝：內(nèi)層無菌自封袋；防壓泡沫盒；外層防壓保溫氣泡袋；說明書

細(xì)胞來源：ATCC、sciencell、ICLC

貨期：1-2周

運(yùn)輸方式：快遞運(yùn)輸

售后：收到細(xì)胞后12天，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有質(zhì)量問題（如污染，死亡，快遞運(yùn)輸?shù)仍颍r(shí)，應(yīng)出具書面質(zhì)量問題報(bào)告并及時(shí)通知銷售人員，我們將盡快為您解決！

?Hepa 1-6細(xì)胞 Hepa 1-6小鼠肝癌細(xì)胞

?三、細(xì)胞生長(zhǎng)條件：

一、組成：

組份 數(shù)目

細(xì)胞 1 T-25瓶

細(xì)胞說明書 一份

二、細(xì)胞簡(jiǎn)介：

生長(zhǎng)特性： 貼壁生長(zhǎng)

細(xì)胞來源： 從ATCC/中科院/協(xié)和醫(yī)院等地引進(jìn)

培養(yǎng)條件： 培養(yǎng)基：1640 +10%FBS（推薦德國BI 04-002-1A

優(yōu)等胎牛血清）

氣相：空氣95%，二氧化碳5%

溫度：37℃

培養(yǎng)： 一、貼壁細(xì)胞

1.用75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒，將其平躺置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行2-3小時(shí)的緩沖，.然后置于無菌操作臺(tái)，打開瓶口，將其中的培養(yǎng)液去掉，再往其中加入5-6mL新鮮培養(yǎng)基并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及培養(yǎng)基顏色變化對(duì)其進(jìn)行換液以及傳代；

2.待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底面積80%-90%，需要對(duì)其進(jìn)行傳代，di一次傳代比例為1:2。

3傳代步驟：將0.25%含EDTA胰酶置于37°預(yù)熱，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，往培養(yǎng)瓶中加入1mlPBS，輕晃洗滌后棄去。往瓶中加1ml預(yù)熱好的胰酶，置于37°孵育消化（di一次消化需時(shí)常取出置于顯微鏡下觀察，以顯微鏡下細(xì)胞觸角回收變圓、輕拍瓶壁見細(xì)胞脫落為佳消化時(shí)間，記錄佳消化時(shí)間，以便于下次消化），消化好后加入1ml*培養(yǎng)基終止消化。用移液槍輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞，使之*脫落，然后收集細(xì)胞懸液，1200rpm離心3min，棄上清，加入*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行傳代。

二、懸浮細(xì)胞

1.用75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒，然后置于無菌操作臺(tái)，打開瓶口，輕輕吹打后，將其中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，然后1200rpm離心3min，去上清；

2.將離心好的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T-25瓶中，并加入5-6mL新鮮培養(yǎng)基，然后將其置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及培養(yǎng)基顏色變化對(duì)其進(jìn)行換液（離心后去舊液，加入新鮮培養(yǎng)基）；

3.顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)目比較多時(shí)，對(duì)其進(jìn)行傳代，di一次傳代比例為1:2（離心后平均分成兩瓶培養(yǎng)）。

細(xì)胞總數(shù)： 1~3*106

傳代周期： 2-3天

傳代比例： 1:2~1:4

換液頻率： 2-3天

凍存液： 90%FBS+10%DMSO

四、注意事項(xiàng)：

1 收到細(xì)胞后首先觀察T-25瓶是否有損壞、漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。

2 瓶中運(yùn)輸?shù)呐囵B(yǎng)液不能重復(fù)使用，請(qǐng)換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)

3 對(duì)于貼壁細(xì)胞，若大部分細(xì)胞漂浮，置于培養(yǎng)箱隔夜觀察，大部分漂浮細(xì)胞重新貼壁，表明細(xì)胞活力正常，繼續(xù)培養(yǎng)，剩余漂浮的細(xì)胞可以去掉；若大部分細(xì)胞仍然不貼壁，將漂浮的細(xì)胞離心收集，用臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活力，并與本公司銷售人員及時(shí)聯(lián)系。

4 建議客戶收到細(xì)胞后不同倍鏡各拍幾張細(xì)胞的照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，如細(xì)胞狀態(tài)出現(xiàn)問題請(qǐng)于72h內(nèi)與本公司銷售聯(lián)系，以便于更好的幫您解決問題，超過時(shí)間我段，本公司則默認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)良好，不免費(fèi)對(duì)后續(xù)細(xì)胞狀態(tài)問題進(jìn)行售后。

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做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的同學(xué)看過來。

選擇上海琛藝生物細(xì)胞有3個(gè)理由：

1、細(xì)胞狀態(tài)好，形態(tài)佳，易成活，是市面上比較好養(yǎng)的細(xì)胞之一;

2、物流迅速，復(fù)蘇好后發(fā)貨，次日就能到;

3、使用我司推薦的進(jìn)口品牌血清進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，效果更佳。

細(xì)胞保種心得：

首先，細(xì)胞采購的運(yùn)輸形式一般分為兩種，一種是直接寄送凍存細(xì)胞，一種是復(fù)蘇后寄送活細(xì)胞。前者是由液氮中取出細(xì)胞凍存管，采用干冰運(yùn)輸；后者是將細(xì)胞復(fù)蘇至T-25培養(yǎng)瓶中，采用常溫運(yùn)輸。兩者各有優(yōu)缺點(diǎn)，di一種方式的優(yōu)點(diǎn)是可以長(zhǎng)途運(yùn)輸，因?yàn)榧?xì)胞在干冰中相對(duì)穩(wěn)定，一般可以保證數(shù)周之內(nèi)不影響細(xì)胞活性，但缺點(diǎn)是運(yùn)輸成本高，且細(xì)胞復(fù)蘇是很復(fù)雜的過程，如果細(xì)胞復(fù)蘇后狀態(tài)不佳，則很難界定是來源的問題還是復(fù)蘇操作的問題；而第二種方式的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞收到后可以直接通過觀察來大體了解細(xì)胞狀態(tài)，并且對(duì)運(yùn)輸?shù)囊笙鄬?duì)較低，缺點(diǎn)則是只適合短途運(yùn)輸，因?yàn)榧幢氵\(yùn)輸時(shí)培養(yǎng)基中不添加血清，細(xì)胞還是會(huì)不斷增殖，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿后，細(xì)胞的狀態(tài)會(huì)隨時(shí)間的增加而不斷變差。綜上，如果是從國外大型細(xì)胞庫采購，一般采用di一種方法，既能適應(yīng)長(zhǎng)途運(yùn)輸，且大型細(xì)胞庫的凍存細(xì)胞質(zhì)量普遍較好，在良好的操作下復(fù)蘇成活率很高；如果是從國內(nèi)細(xì)胞庫采購，則一般采用第二種方法，方便收到細(xì)胞時(shí)能較好掌握細(xì)胞狀態(tài)，并且降低運(yùn)輸成本。

細(xì)胞分別針對(duì)兩種運(yùn)輸方式來談下對(duì)新細(xì)胞的處理過程：

對(duì)于直接寄送凍存細(xì)胞的情況，首先要檢查的就是細(xì)胞收到后是否有足量剩余干冰，如果干冰不足，或是已經(jīng)沒有干冰，則細(xì)胞狀態(tài)可能會(huì)收到影響，建議盡快復(fù)蘇；如果有足量干冰，建議先轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱過夜，于第二天按正常流程復(fù)蘇，即37℃水浴鍋中快速融解，低速離心后去除含DMSO的凍存液，換入適合細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)基，輕柔吹勻后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，補(bǔ)足培養(yǎng)基；一般貼壁細(xì)胞在24h內(nèi)即可觀察到細(xì)胞貼壁，從而判斷細(xì)胞狀態(tài)，懸浮細(xì)胞則復(fù)蘇后即可觀察細(xì)胞狀態(tài)。對(duì)于凍存時(shí)間較長(zhǎng)的細(xì)胞，可能需要傳代1到2次后，細(xì)胞才會(huì)調(diào)整到正常狀態(tài)，所以細(xì)胞復(fù)蘇后如果狀態(tài)不佳，不要灰心，仍要細(xì)心培養(yǎng)。

對(duì)于復(fù)蘇后寄送活細(xì)胞的情況，則細(xì)胞收到后要先檢查細(xì)胞瓶是否有破損，細(xì)胞瓶在運(yùn)輸中很有可能受到碰撞和擠壓，導(dǎo)致瓶體受損。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞瓶受損，則需要盡快處理，該棄就棄。如果細(xì)胞瓶完好，則用酒精消毒瓶身，去除封口膜，然后置于37℃培養(yǎng)箱中靜置1-2h。待細(xì)胞穩(wěn)定后，觀察細(xì)胞狀態(tài)，并及時(shí)記錄，因?yàn)楹芏鄧鴥?nèi)細(xì)胞庫都是可以反饋細(xì)胞狀態(tài)的，如果收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)不佳甚至污染，是可以要求重新寄送的。細(xì)胞如沒有異常，則盡快傳代并更換適合細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)基。由于新細(xì)胞一般都是di一次接觸，細(xì)胞傳代過程中尤為需要注意胰酶消化時(shí)間，消化時(shí)間過短或過長(zhǎng)都會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。我建議大家采用低濃度胰酶消化，消化時(shí)縮短放培養(yǎng)箱和觀察的間隔時(shí)間，以便盡可能找到合適的消化時(shí)間。

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作：

1、培養(yǎng)瓶的包被：包被液如多聚賴氨酸（PLL，ScienCell品牌）或纖維粘連蛋白（BPF，ScienCell品牌），以無菌水稀釋至2 ug/cm2的濃度包被培養(yǎng)瓶。37度孵箱1小時(shí)或4度過夜，從包被好的培養(yǎng)瓶中回收多聚賴氨酸，并用無菌水洗滌培養(yǎng)瓶2遍。包被好的培養(yǎng)瓶不要放置超過24小時(shí)，其中的包被液可吸出重復(fù)使用2-3次，注意不要污染。

2、*培養(yǎng)基的配置：以內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（ECM，ScienCell品牌）為例，把配套的胎牛血清（FBS，ScienCell品牌）、生長(zhǎng)因子（ECGS，ScienCell品牌）和雙抗（P/S，ScienCell品牌）加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液（ECM，ScienCell品牌）中。重新貼好標(biāo)簽，并混勻培養(yǎng)基。

二、原代細(xì)胞復(fù)蘇方法：

1、從液氮中取出原代細(xì)胞冷凍管，迅速投入37～38 ℃水浴中，其間可以輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)胞，加快融化速度，大約需要1分鐘時(shí)間。

2、5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)基稀釋至原體積的10倍以上，加入培養(yǎng)瓶中，再用1ml培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞凍存管，保證細(xì)胞都被加入培養(yǎng)瓶中，靜置于孵箱，12-16小時(shí)后更換培養(yǎng)基（除去DMSO）。以后每2天換一次液，保證細(xì)胞狀態(tài)良好。

三、原代細(xì)胞傳代方法：酶消化法

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70-80%左右可以傳代，傳代比例以1:2或1:3為佳。具體方法如下：

1、棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，用PBS洗滌培養(yǎng)瓶2遍，加入0.25%的胰酶消化液（Trypsin-EDTA，ScienCell品牌，貨號(hào)0103），以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)。37度孵育4分鐘左右，輕拍培養(yǎng)瓶側(cè)面，顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，直到80%細(xì)胞呈現(xiàn)圓形。

2、細(xì)胞消化好后，加入胰酶中和液（TNS，ScienCell品牌，貨號(hào)0113），并輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，形成細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘。

3、棄去上清液，以1-2ml新鮮培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞并吹打均勻，接種于包被好的新培養(yǎng)瓶中，瓶中已有10ml左右的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)基。