U937-LUC人白血病細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記 培養(yǎng)說(shuō)明

U937-LUC人白血病細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記 培養(yǎng)說(shuō)明

?細(xì)胞名稱(chēng)   U937-LUC人白血病細(xì)胞

?組織  U937-LUC人白血病細(xì)胞

?母細(xì)胞來(lái)源  客戶(hù)

?轉(zhuǎn)染方法與標(biāo)記過(guò)程的描述 慢病毒轉(zhuǎn)染Hygromycin篩選 

1.質(zhì)粒部分

1.酶切載體：pGL4.10（luc2）由酶切獲得1400bp的luc2基因片斷；EGFP和mCherry片段由PCR擴(kuò)增獲得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A載體酶切線性化。

2.電泳和膠回收：上述酶切產(chǎn)物DNA電泳，TAKARA試劑盒膠回收，回收產(chǎn)物取少量電泳鑒定。

3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A線性化載體，連接使用20ul體系，25℃，10min。

4.轉(zhuǎn)化：感受態(tài)菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入連接產(chǎn)物，靜置25min后在水浴42℃，45sec熱休克，后加入250ul無(wú)抗培養(yǎng)基225轉(zhuǎn)搖菌1h，將轉(zhuǎn)化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過(guò)夜。

5.挑取單克隆：觀察平板后挑取15個(gè)單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養(yǎng)基搖菌管中，255轉(zhuǎn)搖菌6.5h。

6.小抽質(zhì)粒與鑒定：使用堿裂解法小抽，質(zhì)粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鑒定: 重組質(zhì)粒用通過(guò)酶切鑒定。

7.熒光素表達(dá)鑒定: 重組質(zhì)粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下簡(jiǎn)稱(chēng)Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下簡(jiǎn)稱(chēng)Mluc） 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞：DNA定量后，使用PEI轉(zhuǎn)染Gluc或Mluc至24孔板已預(yù)鋪的293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水，其中一管加入1ug量的質(zhì)粒（DNA體積=1ug/DNA濃度），輕輕震蕩混勻，再輕微離心；在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻，輕微離心，然后把PEI管中的溶液加入含有的質(zhì)粒管中，室溫孵育20min。將脂質(zhì)體包繞DNA的混合液加入需要轉(zhuǎn)染的24孔內(nèi)，37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)，8小時(shí)后換培養(yǎng)液。

8.報(bào)告基因檢測(cè)：Passive Lysis Agent裂解細(xì)胞，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性，陽(yáng)性對(duì)照共同進(jìn)行單報(bào)告基因檢測(cè)。

9.質(zhì)粒中抽：取1ml轉(zhuǎn)染報(bào)告基因檢測(cè)正確的菌液加入100ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中搖菌過(guò)夜，使用Invitrogen試劑盒中抽，產(chǎn)物電泳鑒定，－20℃保存。

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1.慢病毒包裝部分

1. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，293T在10cm培養(yǎng)盤(pán)中的細(xì)胞達(dá)到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養(yǎng)盤(pán)中。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞在培養(yǎng)盤(pán)中密度達(dá)到80％。采用脂質(zhì)體PEI轉(zhuǎn)染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質(zhì)粒VSV G, Packaging Mix以及構(gòu)建的Gluc或Mluc質(zhì)粒15µg共轉(zhuǎn)染。6h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基。

2．提取病毒上清：轉(zhuǎn)染48-72hours后，將含有毒液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細(xì)胞碎片。

3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過(guò)濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。

1.慢病毒感染&篩選

1.感染前一天(Day1)，消化4T1細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞鋪于24孔板中（以便在感染前細(xì)胞達(dá)到30%-50%的匯合度，37°C過(guò)夜孵化細(xì)胞。

2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200µl加入細(xì)胞中。

3.向每孔加入Polybrene達(dá)到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過(guò)夜。

4.(Day3)移去含有慢病毒的培養(yǎng)基，加入500µl*培養(yǎng)基。

5.(Day4)換液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）來(lái)選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。

6.(Day4－7），每24h換液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）來(lái)選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。

維持培養(yǎng)。

7.(Day8－12）細(xì)胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤(pán)和10cm盤(pán)中100µg/ml Hygromycin維持培養(yǎng)。

8. 4T1-Gluc/Mluc細(xì)胞系鑒定: 取5×104細(xì)胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性，陽(yáng)性對(duì)照共同進(jìn)行單報(bào)告基因檢測(cè)。GFP和mCherry表達(dá)通過(guò)熒光顯微鏡觀察。

?培養(yǎng)條件 ：置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清（FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)一天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。

?細(xì)胞傳代所需時(shí)間：1天/代 

?篩選標(biāo)記維持壓力和選擇壓力：Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。

?體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：

1.4T1-Gluc 和4T1-Mluc熒光顯微鏡照片(100×)：

2.細(xì)胞裂解液的發(fā)光值，數(shù)據(jù)—化學(xué)發(fā)光儀(Berthold Lumat LB 9501)檢測(cè)。

A2780/Taxol-Luc，Luciferase螢火蟲(chóng)酶熒光穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株人卵巢癌紫杉醇耐藥株-NTCC保藏中心

【Organism物種來(lái)源】Animal 

【Tissue組織來(lái)源】 

【Cell Type細(xì)胞類(lèi)型】 

【Product Format產(chǎn)品狀態(tài)】 frozen/live culture

【Morphology細(xì)胞形態(tài)】 

【Culture Properties細(xì)胞特性】 

【Biosafety Level生物安全級(jí)別】 1/2

Biosafety classification is based on U.S. Public Health Service Guidelines, it is the responsibility of the customer to ensure that their facilities comply with biosafety regulations for their own country.

【Disease細(xì)胞源疾病】

【Age年齡】 

【Gender性別】 Male/Female

【Storage Conditions保存條件】 liquid nitrogen vapor phase

【Karyotype染色體組型】 

【Images細(xì)胞圖片】 Cell Micrograph

【Derivation衍生細(xì)胞】

【Clinical Data臨床數(shù)據(jù)】 

【Comments其他描述】 

【Complete Growth Medium*培養(yǎng)基】 The base medium for this cell line is DMEM/RPMI-1640 Medium. To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: fetal bovine serum to a final concentration of 10%. 

【Subculturing傳代方法】 

Volumes are given for a 75 cm2 flask. Increase or decrease the amount of dissociation medium needed proportionally for culture vessels of other sizes.

Remove and discard culture medium.

Briefly rinse the cell layer with 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA solution to remove all traces of serum that contains trypsin inhibitor.

Add 2.0 to 3.0 mL of Trypsin-EDTA solution to flask and observe cells under an inverted microscope until cell layer is dispersed (usually within 5 to 15 minutes).

Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37°C to facilitate dispersal.

Add 6.0 to 8.0 mL of complete growth medium and aspirate cells by gently pipetting.

Add appropriate aliquots of the cell suspension to new culture vessels.

Incubate cultures at 37°C.

Subc*tion Ratio: A subc*tion ratio of 1:2 to 1:6 is recommended

Medium Renewal: 2 to 3 times per week

【Cryopreservation凍存條件】 

【Freeze Medium凍存培養(yǎng)基】Complete growth medium supplemented with 5% (v/v) DMSO

【Storage Temperature保存溫度】 Liquid nitrogen vapor phase

【Culture Conditions培養(yǎng)條件】 

【Atmosphere培養(yǎng)環(huán)境】 Air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5%

【Temperature培養(yǎng)溫度】 37°C

【STR Profile圖譜】 

【Population Doubling Time倍增殖時(shí)間】

【References參考文獻(xiàn)】