致病性大腸埃希氏菌的生物學(xué)特性與檢驗方法！

       致病性大腸埃希氏菌的生物學(xué)特性與檢驗方法！

致病性大腸埃希氏菌是指能使人、動物(尤其是嬰兒和幼齡動物)感染及人食物中毒的一群大腸桿菌。

在自然界中本菌分布廣泛，主要寄居場所是人和其它溫血動物的腸道中，是一類條件性致病菌。致病性大腸埃希氏菌的形態(tài)特點、培養(yǎng)特性和生化特性均與非致病性大腸埃希氏菌非常相似，以至難以區(qū)分，只能通過血清學(xué)的方法，從抗原結(jié)構(gòu)的差異來區(qū)別。在致病性大腸埃希氏菌中，有些血清型能夠引起人的食物中毒，有些血清型能夠引起人的腸道內(nèi)外感染。還有一些血清型的菌株能夠使畜禽發(fā)病，危害畜牧業(yè)，降低畜產(chǎn)食品的質(zhì)量。致病性大腸埃希氏菌可從飲用水，未消毒牛乳，病畜臟器、禽類及其人畜糞便污染的各種食品中分離出來。

致病性大腸埃希氏菌屬主要分為五大類，首先根據(jù)發(fā)病機理分為三大類，

1、產(chǎn)毒素型大腸埃希氏菌(ETEC)，

2、侵襲型大腸埃希氏菌(EIEC)

3、腸道致病性大腸埃希氏菌(EPEC)

近來又提出另外兩類

4、即出血性大腸埃希氏菌(EHEC)

5、腸粘附性大腸埃希氏菌(EAEC)

但是，致病性大腸埃希氏菌的致病性是一個很復(fù)雜的問題，也并非由某一方面的因素所決定。

致病性大腸埃希氏菌中，一般認(rèn)為能產(chǎn)生耐熱{ST)和不耐熱(LT)腸毒素的兩種菌株均可引起人的食物中毒。引起大腸埃希氏菌幣毒的主要是一些動物性食品，如乳與乳制品、肉類、水產(chǎn)品等，牛和豬是傳播這種病菌、引起中毒的主要原因。

1996年7月在日本就發(fā)生了大腸桿菌0157型引起的食物中毒，造成9017多人中毒，10人死亡，其原因與生食蘿卜苗有關(guān)，其中92例并發(fā)出血性腸炎及出血性尿毒癥。2001年，再江蘇、安徽等地爆發(fā)的腸出血性大腸桿菌0157:H7食物中毒，造成177人死亡，中毒人數(shù)超過2萬人。

如仔豬黃、白痢、豬水腫病、牛腹瀉和敗血癥等均可由大腸桿菌引起。

一、生物學(xué)特性

1、形態(tài)與染色特性

菌體兩端鈍圓、中等大小，桿狀(有時呈卵圓形)、1—3um X 0.6um、周生鞭毛，能運動，不產(chǎn)生莢膜，革蘭氏陰性，而且一般是對堿性染料著色較好，但有時兩端著色較濃，要與巴氏桿菌區(qū)分開來。

2、培養(yǎng)特性

1）需氧及兼性厭氧菌

2）對營養(yǎng)的要求不高，在普通瓊脂上就生長良好，在15C-45℃范圍內(nèi)均可生長，但生長溫度為37℃，pH為7.2—7.4。

3）在普通瓊脂平板上培養(yǎng)24小時，可形成圓形、凸起、光滑、濕潤、半透明、邊緣整齊、中等大小的菌落．其菌落與沙門氏菌比較相似，但是，大腸桿菌菌落對光(45角折射)觀察可見熒光。

4）在肉湯培養(yǎng)基中生長18～24小時變?yōu)榫鶆驕啠蟮撞砍霈F(xiàn)粘性沉淀物，并伴有臭味。

5）部分菌落可出現(xiàn)β溶血。

6）在遠藤瓊脂上長成帶金屬光澤的紅色菌落

7）在S．S瓊脂平板上多不生長，少數(shù)生長的細(xì)菌，也因發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸而形成紅色菌落；

8）在伊紅美蘭瓊脂上形成具有金屬光澤的黑色菌落

9）在麥康凱瓊脂上培養(yǎng)24小時后孤立菌落呈紅色

3、生化特性

1）可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有些不典型的菌株不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵乳糖；

2）不同菌株對蔗糖，衛(wèi)矛醇、水楊苷發(fā)酵結(jié)果不一致。

3）本菌可使賴氨酸脫鞍、不能使苯丙氨酸脫羧。

4）不產(chǎn)生H2S，不液化明膠，不分解尿素，

5）不能在培養(yǎng)基上生長，靛基質(zhì)試驗陽性，V-P試驗陰性，不利用枸櫞酸鹽。后四項生化特性是典型的大腸埃希氏菌，與此不一致的即為非典型大腸埃希氏菌菌。

IMViC試驗：如IMViC試驗為+、+、-、-，且乳糖發(fā)酵，表明被檢物已有糞便污染，有發(fā)生腸道傳染病的危險，這是衛(wèi)生細(xì)菌中常用的檢測指標(biāo)。（I：吲哚形成試驗，M：甲基紅試驗，Vi：V-P試驗，C：枸櫞酸鹽利用試驗）

4、血清學(xué)特性

大腸埃希氏菌的抗原構(gòu)造主要由菌體抗原(O)，鞭毛抗原(H)和莢膜抗原(K)三部分組成。

1）O抗原

成分為細(xì)胞壁上的糖、類脂和蛋白質(zhì)復(fù)合物，也是細(xì)菌的內(nèi)毒素，熱穩(wěn)定性較強，高壓蒸汽處理2小時不被破壞。每一血清型只含有一種O抗原，本菌已發(fā)現(xiàn)有167種O抗原，分別以阿拉伯?dāng)?shù)字表示。

2）H抗原

為蛋白質(zhì)；一種大腸埃希氏菌只有一種H抗原，無鞭毛則無H抗原，H抗原能在80度被破壞，也能被酒精破壞。H抗原共有64種。

3）K抗原

是細(xì)胞外部的莢膜或的表面物質(zhì)，又稱包膜抗原。新分離的大腸埃希氏菌70％具有K抗原。根據(jù)K抗原耐熱的敏感性．可把K抗原分為A、B、L三類，共有103種，致病性大腸埃希氏菌的抗原主要為B抗原，少數(shù)為L抗原，B抗原與L抗原均可在煮沸后被破壞，A抗原耐熱性強，可耐受煮沸1小時而不被破壞。，

O抗原可將大腸埃希氏菌分成若干血清群，再根據(jù)K抗原和H抗原進一步分為若干個血清型或亞型，根據(jù)大腸埃希氏菌抗原的鑒定結(jié)果，寫出其抗原式如O111：K58(B)H12，一般認(rèn)為H抗原與致病性無關(guān)，因此，一般不需要進行H抗原的鑒定。

5、抵抗力

抵抗力中等，各菌型之間存在差異。此菌對青霉素有中等抵抗力，對一般消毒劑都比較敏感。對氯尤為敏感，水中游離氯達到0．2mg／L時，即可殺死此菌。此菌在土壤中、水中及糞便中可存活數(shù)月以上。

6、毒素特性

有些大腸埃希氏菌產(chǎn)生腸毒素，

1）不耐熱(LT)腸毒素（heat-labile enterotoxin，LT）：化學(xué)成分為蛋白質(zhì)，分子量較大，60℃ 30分破壞，具有免疫原性，可引起腸道分泌增加，出現(xiàn)腹瀉。

2）耐熱腸毒素（heat-stable enterotoxin，ST）：分子量較小，無抗原性，100℃ 30分鐘，仍有活性，可引起腸分泌增加。

二、致病性

致病性大腸埃希氏菌屬引起酌食物中毒主要有兩種類型，一種是腸道內(nèi)感染，另一種是腸道外感染，兩者具有不同的機理和癥狀：

1、腸道內(nèi)感染

1）腸毒素型大腸桿菌（ETEC）：主要引起腹瀉（幼畜或雛雞），約有40個血清型。腸毒素型菌株進入腸道后主要在小腸內(nèi)繁殖，不損害腸上皮細(xì)胞。繁殖過程中產(chǎn)生腸毒素。

2）腸致病型大腸桿菌（EPEC）：是引起嬰兒腹瀉的主要病原菌，該菌不產(chǎn)腸毒素，也無侵襲力，致病機理不清，約有18個血清型。

3）腸侵襲型大腸桿菌（EIEC）：較少見，該菌不產(chǎn)腸毒素，但侵襲大腸腸壁上皮細(xì)胞，引起炎癥反應(yīng)，形成潰瘍，約有8個血清型。引起類似痢疾的癥狀。

2、腸道外感染

三、主要癥狀

腸道內(nèi)感染主要造成腹瀉與痢疾樣疾?。荒c道外感染主要引起尿路感染，新生兒腦膜炎、敗血癥及其他部位的感染。

致病菌引起的食物中毒是感染型和毒素型的綜合作用，致病性大腸桿菌引起的食物中毒主要癥狀為急性腸胃炎，潛伏期為12～24小時，臨床出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、發(fā)熱(體溫一般不超過39℃)、頭痛、腹痛等，病程一般為1—3天。

四、流行病學(xué)特點

1、發(fā)病季節(jié)多發(fā)生在夏秋季

2、引起中毒的食品種類

與沙門氏菌相同。

3、食品種大腸埃希氏菌的來源

由于大腸桿菌存在于人和動物的腸道中，健康人腸道致病性大腸埃希氏菌率為2—8％，高者達44％，而成人患腸炎、嬰兒患腹瀉時，致病性大腸埃希氏菌率較健康人高，達29—52％。大腸桿菌隨糞便排出而污染水源和土壤，進而直接或間接污染食物。

五、檢驗方法

致病性大腸埃希氏菌的檢驗應(yīng)按《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)——食品衛(wèi)生檢驗方法(微生物學(xué)部分)》(GB489．6-84)的有關(guān)內(nèi)容進行檢驗。

（一）增菌培養(yǎng)

1、以無菌操作的方法稱取樣品25g，加入225ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，可用滅菌砂在研缽中磨碎或以均質(zhì)器打碎樣品。

2、取適量接種于乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，測定大腸菌群MPN，其余移入500ml三角瓶中于36±1℃培養(yǎng)6小時。挑取一環(huán)，接種于一管30ml腸道菌增菌湯中，42℃增菌培養(yǎng)18小時。

（二）分離培養(yǎng)

1、將乳糖膽鹽發(fā)酵陽性管液與增菌液分別劃線接種于麥康凱或伊紅美蘭瓊脂平板上。

2、于36±1℃培養(yǎng)18—24小時觀察菌落

對于污染嚴(yán)重的食品可直接按劃線法接種，不經(jīng)過增菌過程。

（三）生化試驗

1、初篩試驗

選取在麥康凱或伊紅美蘭平板上發(fā)酵乳糖或不發(fā)酵乳糖的菌落5個以上，分別接種于克氏雙糖鐵、pH7.2尿素和阿拉伯糖中．經(jīng)36C培養(yǎng)18～24小時，棄去H2S陽性或尿素酶陽性或阿拉伯糖陰性的培養(yǎng)物。

2、復(fù)篩試驗

把篩留下的培養(yǎng)物分別接種于緩沖葡萄糖蛋白胨和KCN培養(yǎng)基中，經(jīng)36+1℃培養(yǎng)48小時，觀察生長結(jié)果并做V-P試驗，棄去V-P陽性及KCN陽性的培養(yǎng)物。

3、證實試驗

致病性大腸埃希氏菌屬除氧化酶陰性，革蘭氏陰性的特征以外，還有以下特性：葡萄糖產(chǎn)酸+，葡萄糖產(chǎn)氣+／一，乳糖產(chǎn)酸+90％，檸檬酸鹽—，尿素酶一，KCN-，V-P-，動力+或—，阿拉伯糖十，靛基質(zhì)十95％：可按這些主化特性進一步證實其是否為致病性大腸埃希氏菌屬。

（四）血清學(xué)試驗

1、致病性大腸埃希氏菌血清學(xué)試驗

假定試驗：

從平板上選菌落生長稠密處挑取培養(yǎng)物，用致病性大腸埃希氏菌三種OK多價血清做玻片凝集試驗。不凝集的培養(yǎng)物可做陰性報告。

證實試驗：

2、侵襲性大腸埃希氏菌血清學(xué)試驗

在平板上菌落生長稠密處挑取培養(yǎng)物，用侵襲性大腸埃希氏菌診斷血清做玻片凝集試驗，侵襲性大腸埃希氏菌診斷血清包括兩種：OK多價血清和9種OK單價血清：

（五）產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌毒素試驗

1、動物試驗

將經(jīng)過生化證實試驗的大腸埃希氏菌培養(yǎng)物接種肉湯管，于36+1℃培養(yǎng)24小時，3000轉(zhuǎn)／分離心30分鐘。取上清液用G6濾器過濾后分作兩份，一份加熱60℃30分鐘，供ST測定用，另一份不加熱，供LT測定用。

1）家免結(jié)軋回腸段試驗：

取體重為2kg的家兔，禁食使腸內(nèi)容物排空。麻醉后剖腹，取出回腸段，按10～15cm為一段，分段結(jié)扎，取一段注射肉湯2mL作為陰性對照，另一段注射已知產(chǎn)毒菌肉湯培養(yǎng)物的上清液2ml作為陽性對照。其他各段分別注射待試菌株肉湯培養(yǎng)物的濾液2mL。將腹壁縫合。

測定LT時，于注射后18小時剖腹檢查

測定ST時，于注射后6—8小時剖腹檢查

取出腸管分別抽取腸段的積液，測定其容量，并測定腸段的長度。積液量(mL)與腸段長度(cm)之比大于l者為陽性。

2）乳鼠灌胃試驗：

2、雙向瓊脂擴散試驗

將被檢菌按5點環(huán)形接種于Elek氏培養(yǎng)基上，以同樣操作共做兩份，36±1℃培養(yǎng)48小時，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素紙片，36+1℃經(jīng)5—6時，使抗生素滲入瓊脂中，在五點環(huán)形菌苔各5mm處的，挖一個直徑4mm的園并用一滴瓊脂墊底。在一份平板的孔內(nèi)滴加LT抗毒素30ul，另一份平板的孔內(nèi)滴加ST毒素30ul。放于36+1℃經(jīng)15～20小時觀察結(jié)果，在菌斑和抗毒素之間出現(xiàn)白色沉淀帶為陽性，無沉淀帶者為陰性。

（六）豚鼠角膜試驗

供測定侵襲性大腸埃希氏菌用，將經(jīng)過生化證實試驗的待試菌株18—20小時瓊脂培養(yǎng)物，用肉湯洗下，使成每lml含菌9億個菌懸液，作為接種材料。

體重400--500g的健康豚鼠(角膜與結(jié)膜外觀正常，并經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)檢查)的角膜上接種待試菌懸液1滴。

48小時后觀察結(jié)果，結(jié)膜充血浮腫、角膜混濁、眼內(nèi)充盈淚液或漿液性分物者為陽性，自結(jié)膜囊取樣分離細(xì)菌，鑒定應(yīng)與原接種菌一致。

（七）結(jié)果報告

根據(jù)以上生化試驗、血清學(xué)試驗、腸毒素試驗和豚鼠角膜試驗的結(jié)果出報告，如果是產(chǎn)毒大腸埃希氏菌時應(yīng)有腸毒素試驗的結(jié)果；如果是侵襲性大腸埃希氏蔭應(yīng)有豚鼠角膜試驗和血清學(xué)試驗的結(jié)果；如果是腸致病性大腸埃希氏菌時應(yīng)有血清學(xué)試驗結(jié)果。

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