高通量重組蛋白表達(dá)技術(shù)在大腸桿菌中的應(yīng)用

前言

在當(dāng)今的生物技術(shù)領(lǐng)域，高通量重組蛋白表達(dá)技術(shù)在基礎(chǔ)研究和商業(yè)應(yīng)用中扮演著非常重要的角色。隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，研究人員對(duì)大規(guī)模蛋白表達(dá)和純化的需求日益增長(zhǎng)，大腸桿菌因其易于遺傳操作、低成本、生長(zhǎng)迅速成為生產(chǎn)重組蛋白的首-選微生物宿主。本文將綜述大腸桿菌中高通量重組蛋白表達(dá)的現(xiàn)狀和未來(lái)展望，探討從目的基因獲取到蛋白表達(dá)和純化的先-進(jìn)技術(shù)，并討論如何克服重組蛋白表達(dá)過(guò)程中的挑戰(zhàn)。

高通量重組蛋白表達(dá)技術(shù)

高通量研究是一種能夠同時(shí)檢測(cè)數(shù)千個(gè)生物分子，使大規(guī)模重復(fù)成為可能的研究。20世紀(jì)90年代初，第-一臺(tái)DNA測(cè)序儀被開(kāi)發(fā)出來(lái)，人類基因組計(jì)劃隨之開(kāi)啟，高通量技術(shù)在DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和代謝物檢測(cè)的需求也急劇增加。自該技術(shù)提出以來(lái)，大腸桿菌中高通量重組蛋白表達(dá)和純化已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。

1. 目的基因的制備

獲取目的基因是重組蛋白表達(dá)的第-一步。傳統(tǒng)的方法是從cDNA文庫(kù)中直接克隆基因，但這種方法存在局限性，如從庫(kù)中篩選基因較為費(fèi)時(shí)以及難以添加融合標(biāo)簽等。高通量PCR技術(shù)是目前獲取目的基因最-常用的技術(shù)，設(shè)計(jì)引物并調(diào)整好參數(shù)后，即可在PCR儀中自動(dòng)完成目的基因的制備。 

2. 表達(dá)載體的高通量構(gòu)建

研究人員開(kāi)發(fā)了多種構(gòu)建表達(dá)載體的克隆方法，包括基于限制性內(nèi)切酶的克隆、重組克隆和不依賴于連接反應(yīng)的克隆等。這些方法各有優(yōu)勢(shì)和局限性，但在近年來(lái)都有顯著改進(jìn)。例如，基于限制性內(nèi)切酶的克隆因其簡(jiǎn)單、高效、通用和成本效益而備受關(guān)注。一個(gè)理想的大腸桿菌表達(dá)載體應(yīng)具備選擇標(biāo)記、復(fù)制起點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、5'非翻譯區(qū)（5'UTR）和翻譯起始位點(diǎn)。此外，融合標(biāo)簽的添加對(duì)于目的基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)同樣至關(guān)重要。

3. 大腸桿菌表達(dá)菌株的選擇和細(xì)胞培養(yǎng)

為保證蛋白質(zhì)表達(dá)成功及其表達(dá)質(zhì)量，應(yīng)選擇合適的大腸桿菌菌株，如BL21及其衍生菌株是較常用的重組蛋白生產(chǎn)菌株。培養(yǎng)大腸桿菌比較簡(jiǎn)單的方法是分批培養(yǎng)，但此方法對(duì)生長(zhǎng)的控制比較有限。近年來(lái)，高通量培養(yǎng)技術(shù)使研究人員能夠在一系列發(fā)酵條件下處理大量樣品，大大加快了生產(chǎn)時(shí)間。

4. 高通量蛋白表達(dá)和純化

高通量平臺(tái)可以快速克隆基因、挑選菌落、分離質(zhì)粒DNA、轉(zhuǎn)化細(xì)菌、表達(dá)和純化蛋白質(zhì)。這些平臺(tái)雖然成本高昂，但為復(fù)雜的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作提供了極大的便利。

結(jié)論與展望

大腸桿菌中的高通量重組蛋白表達(dá)技術(shù)極大的推進(jìn)了重組蛋白的表達(dá)進(jìn)程。盡管存在挑戰(zhàn)，但通過(guò)不斷優(yōu)化和創(chuàng)新，研究人員正在朝著更高效可靠的蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)改進(jìn)。未來(lái)的發(fā)展方向包括進(jìn)一步優(yōu)化克隆方法、開(kāi)發(fā)新的融合標(biāo)簽、改進(jìn)表達(dá)載體和菌株，以及利用高通量技術(shù)實(shí)現(xiàn)從DNA到大規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)的快速轉(zhuǎn)變等。

參考文獻(xiàn)：

Jia B, Jeon CO. High-throughput recombinant protein expression in Escherichia coli: current status and future perspectives. Open Biol. 2016;6(8):160196. doi:10.1098/rsob.160196