突破傳統(tǒng)！高分辨化學(xué)成像顯微鏡，點(diǎn)亮植物真菌單細(xì)胞纖維素成像研究新曙光

導(dǎo)讀

在生命科學(xué)的微觀世界里，纖維素作為植物和真菌細(xì)胞壁的關(guān)鍵構(gòu)成要素，其在單細(xì)胞層面的纖維素等多糖代謝研究一直是科學(xué)家們聚焦的重要領(lǐng)域。然而，傳統(tǒng)成像技術(shù)在這一研究進(jìn)程中卻遭遇了重重困境。傳統(tǒng)的紅外化學(xué)成像技術(shù)因分辨率的局限，無(wú)法對(duì)單個(gè)細(xì)胞中的纖維素進(jìn)行成像；而纖維素等多糖本身又難以被熒光標(biāo)記，這使得傳統(tǒng)熒光顯微鏡也很難在植物和真菌細(xì)胞內(nèi)的纖維素進(jìn)行成像。如此一來(lái)，如何實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞纖維素成像成為了該領(lǐng)域科研工作者亟待攻克的難題。

新型光學(xué)光熱紅外 (O-PTIR) 化學(xué)成像技術(shù)的蓬勃發(fā)展，大幅提升了傳統(tǒng)紅外化學(xué)成像法的空間分辨率，在亞微米空間尺度上實(shí)現(xiàn)對(duì)不同物質(zhì)進(jìn)行特異性的無(wú)標(biāo)記化學(xué)成像。憑借該技術(shù)，科研人員不僅可以對(duì)單個(gè)植物、真菌細(xì)胞壁的纖維素等化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)成像，還能通過(guò)紅外光譜分析纖維素等化學(xué)物質(zhì)的變化來(lái)判斷該物質(zhì)的生成或分解情況，為科研工作者提供更加豐富的纖維素等多糖的代謝信息。

新一代化學(xué)成像顯微鏡

美國(guó)PSC公司研發(fā)的新一代高分辨化學(xué)成像顯微鏡——mIRage，大大地拓展了光學(xué)顯微鏡的應(yīng)用。mIRage不僅具備傳統(tǒng)熒光顯微鏡的熒光成像功能，還采用新型光學(xué)光熱紅外（O-PTIR）技術(shù)，能夠?qū)ξ镔|(zhì)的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行無(wú)熒光標(biāo)記的化學(xué)成像，解決了傳統(tǒng)化學(xué)成像空間分辨率低的問(wèn)題，其化學(xué)成像分辨高達(dá)500 nm，可在亞微米尺度上對(duì)植物或真菌細(xì)胞壁的纖維素、多糖等多種物質(zhì)進(jìn)行成像與波普分析。這為植物代謝組學(xué)、植物細(xì)胞生物學(xué)等多個(gè)生命科學(xué)研究領(lǐng)域提供了新的表征手段。

新一代高分辨化學(xué)成像顯微鏡——mIRage

mIRage的優(yōu)勢(shì)：

• 亞微米空間分辨的紅外光譜和拉曼高光譜成像（~500 nm）；

• 與透射模式相媲美的反射模式下的圖譜效果；

• 非接觸測(cè)量模式—使用簡(jiǎn)單快捷，無(wú)交叉污染風(fēng)險(xiǎn)；

• 很少或無(wú)需樣品制備過(guò)程(無(wú)需薄片), 可測(cè)試厚樣品；

• 可透射模式下觀察溶液中的樣品；

• 實(shí)現(xiàn)同時(shí)同地相同分辨率的IR和Raman測(cè)試；

• 熒光顯微成像實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記樣品快速定位。

mIRage部分應(yīng)用領(lǐng)域

一、 mIRage助力植物細(xì)胞壁化學(xué)成像

在傳統(tǒng)植物細(xì)胞成像中，通過(guò)光學(xué)成像可以觀察到植物細(xì)胞壁的形貌特征，但是普通光學(xué)顯微鏡很難對(duì)組成細(xì)胞壁的纖維素、含羰基木質(zhì)素、不含羰基木質(zhì)素、羰基化合物等成分進(jìn)行成像。而這些物質(zhì)在細(xì)胞壁的內(nèi)的分布、含量等信息對(duì)于植物代謝、根瘤研究等領(lǐng)域都有重要意義。

下圖為mIRage對(duì)單個(gè)植物細(xì)胞的細(xì)胞壁進(jìn)行的化學(xué)成像。通過(guò)對(duì)纖維素、含羰基木質(zhì)素、不含羰基木質(zhì)素、羰基化合物等多種物質(zhì)對(duì)應(yīng)的紅外特征峰進(jìn)行化學(xué)成像，可以得到整個(gè)植物細(xì)胞的細(xì)胞壁化學(xué)成像圖片?？梢郧逦乇憩F(xiàn)出植物細(xì)胞壁的纖維素、木質(zhì)素分布，并區(qū)分該木質(zhì)素是否含有羰基。

下圖為mIRage對(duì)單個(gè)洋蔥上表皮細(xì)胞進(jìn)行的化學(xué)成像。其中左圖為洋蔥上皮細(xì)胞的光學(xué)成像與化學(xué)成像圖片。mIRage對(duì)單個(gè)洋蔥上表皮細(xì)胞內(nèi)的氨基酸、水、纖維素的特征峰進(jìn)行了紅外化學(xué)成像，可以明確地區(qū)分細(xì)胞壁與原生質(zhì)體。同時(shí)可以對(duì)細(xì)胞特定區(qū)域分析紅外光譜，獲得更加詳細(xì)的物質(zhì)信息。

二、 mIRage協(xié)助分析番茄角質(zhì)層化學(xué)性質(zhì)與機(jī)械性能關(guān)系

角質(zhì)層是一種多功能疏水性生物復(fù)合材料，可保護(hù)植物的地上器官。在植物發(fā)育過(guò)程中，植物角質(zhì)層必須適應(yīng)不同的機(jī)械約束，包括延展性和剛度，而其化學(xué)成分、結(jié)構(gòu)異質(zhì)性與機(jī)械性能的對(duì)應(yīng)關(guān)系尚不清楚。

科研人員深入研究了番茄 (Solanum lycopersicum) 果實(shí)角質(zhì)層從早期發(fā)育到成熟的納米機(jī)械性能，以及與化學(xué)和結(jié)構(gòu)異質(zhì)性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，角質(zhì)層結(jié)構(gòu)發(fā)生了微調(diào)，并通過(guò)mIRage化學(xué)成像協(xié)助證明了這些局部區(qū)域機(jī)械性能與化學(xué)和結(jié)構(gòu)異質(zhì)性的梯度相關(guān)性。

下圖為科研人員使用mIRage化學(xué)成像結(jié)合AFM表征的番茄開花后 25天（DPA）角質(zhì)聚合物基質(zhì)橫截面的信息，分析了從角質(zhì)聚合物基質(zhì)表面到表皮細(xì)胞表面的角質(zhì)/多糖比率的梯度變化。結(jié)果顯示，角質(zhì)聚合物基質(zhì)嵌入的多糖量對(duì)角質(zhì)層的彈性模量有顯著影響。脂質(zhì)、多糖和酚類化合物與角質(zhì)聚合物基質(zhì)彈性模量在每個(gè)發(fā)育階段都獲得了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的相關(guān)性。在結(jié)晶纖維素和果膠的彈性模量和拉曼強(qiáng)度之間觀察到正相關(guān)性；相反，脂質(zhì)和香豆酸的拉曼強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)番茄成熟后，角質(zhì)聚合物基質(zhì)會(huì)積累酚類物質(zhì)。

為了闡明角質(zhì)層聚合物中央溝的具體機(jī)械性能及其與角質(zhì)聚合物基質(zhì)化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)的關(guān)系，在三個(gè)發(fā)育階段（即 20、30 和 40 DPA）借助mIRage比較了中央溝和溝的側(cè)面的化學(xué)成像信息（如下圖所示）。20和30 DPA沒(méi)有明顯的角質(zhì)信息，拉曼數(shù)據(jù)直到 40 DPA 階段才顯示出中央溝的強(qiáng)的角質(zhì)特定光譜指紋，證明中央溝是由角質(zhì)組成的，而多糖則逐漸被排除在側(cè)面。溝邊的酚類化合物與結(jié)晶纖維素的相對(duì)積累也發(fā)生了變化，而果膠則集中在中央溝邊。上述數(shù)據(jù)表明，在番茄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，角質(zhì)聚合物基質(zhì)中央溝的化學(xué)成分與溝邊略有不同。這些區(qū)域的脂質(zhì)也觀察到具有不同的大分子排列。

三、 mIRage助力真菌細(xì)胞化學(xué)成像

除了植物細(xì)胞外，mIRage還可以對(duì)真菌細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)成像。在一項(xiàng)針對(duì)能分解纖維素的外生菌根真菌Paxillus involutus研究中，科研人員在纖維素薄膜上培養(yǎng)外生菌根真菌Paxillus involutus，并對(duì)該真菌分解纖維素薄膜的過(guò)程進(jìn)行了化學(xué)成像。

下圖為mIRage對(duì)P. involutus菌絲尖進(jìn)行的化學(xué)成像。圖C中可見纖維素背景，寬度約為 4.6 µm（圖A中的綠色光譜和圖C中的綠色區(qū)域），以及菌絲周圍的纖維素分解區(qū)，該分解區(qū)從菌絲邊緣延伸約 6.3 µm（圖 A中的橙色光譜和圖C中的橙色區(qū)域）。圖C中藍(lán)色區(qū)域顯示的是未受真菌分解影響區(qū)域的化學(xué)成像。圖B顯示了用 mIRage采集的被研究細(xì)胞的可見光圖像。圖B中的紅色矩形表示用mIRage成像區(qū)域即為圖C區(qū)域。

在圖A中的紅外光譜中，1,100 cm^-1至 950 cm^-1波數(shù)區(qū)域的紅外信號(hào)在靠近菌絲處減小；可以觀察到該碳水化合物區(qū)域內(nèi)光譜的明顯變化。由于纖維素氧化導(dǎo)致的1,700 cm^-1至1,600 cm^-1紅外吸收的增加可以與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)肽鍵中C=O的變化導(dǎo)致的波普變化明顯區(qū)分開來(lái)，綜上數(shù)據(jù)表明：纖維素確實(shí)已被 P. involutus 氧化。

四、 mIRage高分辨率表征真菌細(xì)胞纖維素代謝

mIRage的高空間分辨率和光譜質(zhì)量有助于更好地觀察真菌纖維素分解區(qū)域化學(xué)物質(zhì)的細(xì)微變化，用于更進(jìn)一步地表征真菌的纖維素代謝過(guò)程。

下圖利用新一代高分辨化學(xué)成像顯微鏡——mIRage對(duì)圖A真菌的纖維素分解區(qū)進(jìn)行了更加細(xì)致的波普分析：從菌絲的邊緣繪制一組徑向線（白色），并選擇靠近這些線的像素（338 個(gè)綠點(diǎn)）進(jìn)行進(jìn)一步分析。圖B顯示了沿其中一條徑向線上的不同采樣點(diǎn)（及圖A 中的不同色點(diǎn)）的單個(gè)光譜數(shù)據(jù)，表明纖維素分解區(qū)的紅外光譜發(fā)生了逐漸變化。經(jīng)過(guò)分析，可以發(fā)現(xiàn)未改變的纖維素隨著距離菌絲的距離越遠(yuǎn)，含量越高（圖C中藍(lán)點(diǎn)），類似纖維素分解產(chǎn)物的含C = O化合物，隨著距離菌絲的距離越遠(yuǎn)，含量越低（圖C中橙色點(diǎn)）。而且2種物質(zhì)在距離菌絲一定距離后（超出真菌纖維素分解區(qū)）物質(zhì)含量基本持平。

總結(jié)

在以上案例中，mIRage展現(xiàn)了對(duì)單個(gè)植物細(xì)胞或真菌的化學(xué)成像能力。設(shè)備不僅可以對(duì)植物細(xì)胞壁中的纖維素進(jìn)行成像，也可以對(duì)植物細(xì)胞壁中的木質(zhì)素、羰基化合物、角質(zhì)聚合物等多種物質(zhì)進(jìn)行特異性無(wú)標(biāo)記成像。而且，在對(duì)真菌、植物細(xì)胞的化學(xué)成像過(guò)程中，mIRage的高分辨率還可以對(duì)細(xì)小部位（真菌纖維素分解區(qū)、角質(zhì)層聚合物中央溝）內(nèi)的同一物質(zhì)的變化進(jìn)行波普成像，更加準(zhǔn)確地反饋特定物質(zhì)的分布與化學(xué)變化。我們希望該技術(shù)將助力植物代謝組學(xué)、真菌代謝組學(xué)、植物學(xué)等領(lǐng)域的科研工作者做出重要貢獻(xiàn)。

除了上述應(yīng)用外，mIRage這一熒光、紅外、拉曼三合一的化學(xué)成像顯微還在多個(gè)科研領(lǐng)域有所應(yīng)用：

1.  環(huán)境微塑料

微塑料顆粒（~600 nm）的O-PTIR光譜及成像分析

(引自Microscopy Today, 2022, 17, 3, 76-85)

2. 高分子材料

1210 cm^-1處采集的PP/PTFE的O-PTIR光譜和顯微圖像

(引自Materials & Design, 211 (2021), 17, 110157)

3. 半導(dǎo)體

薄膜晶體管顯示器中污染物的O-PTIR分析

器件表面缺陷的紅外和拉曼光譜同步（同時(shí)間、同位置）分析

(引自Microscopy Today, 2020, 28, 3, 26-36)

4. 生命科學(xué)

腦組織的明場(chǎng)顯微圖像、O-PTIR光譜及成像分析

5. 文物鑒定

柯羅19世紀(jì)繪畫作品中鋅皂異質(zhì)性的O-PTIR顯微光譜及成像分析

(引自Anal. Chem. 2022, 94, 7, 3103–3110)

mIRage國(guó)內(nèi)部分發(fā)表文章一覽

? 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)借助mIRage成功實(shí)現(xiàn)對(duì)玉米粉中痕量微塑料的原位可視化表征。該工作發(fā)表在Science of the Total Environment上。

? 中科院過(guò)程工程研究所使用mIRage對(duì)利拉魯肽微球的藥物與載藥顆粒的化學(xué)成分與空間分布進(jìn)行了鑒定，該成果發(fā)表在ACS Applied Materials & Interfaces上。

相關(guān)產(chǎn)品

1、非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測(cè)量系統(tǒng)—mIRage（生物領(lǐng)域）http://true-witness.com/usermanage/default.aspx?pro_promanage

2、超高分辨活細(xì)胞熒光紅外顯微成像系統(tǒng)http://true-witness.com/usermanage/default.aspx?pro_promanage