蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，裂解葡萄糖苷鍵，催化葡萄糖基轉(zhuǎn)移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等，合成相應(yīng)的葡萄糖基低聚糖。此外，SP 還能催化氫醌合成熊果苷，具有ji強(qiáng)的美白效果，在化妝品工業(yè)中具有重要應(yīng)用。

測(cè)定原理：

SP 能夠以磷酸為受體，催化蔗糖產(chǎn)生 1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸變位酶催化下變位為 6-磷酸葡萄糖，在 6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下還原NADP+生成NADPH，導(dǎo)致 340nm 光吸收值增加。測(cè)定 340nm 吸光度增加速率，即可計(jì)算SP 活性。

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存，臨用前加 6ml 蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存，臨用前加 12ml 蒸餾水水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

自備儀器和用品：

天平、低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計(jì)、1 ml 石英比色皿和蒸餾水。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃，離心 10min，取上清待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000g， 4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 操作表

SP 活性計(jì)算公式:

1. 按照蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：37℃，pH6.8 時(shí)，每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 為一個(gè)酶活單位。

SP 活性（nmol/min/mg prot）=

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

DA

e′ d

×V 反總÷V 樣÷Cpr÷T=804×△A÷Cpr

酶活定義：37℃，pH6.8 時(shí)，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 為一個(gè)酶活單位。

SP 活性（nmol/min/g 鮮重）=

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

DA

e′ d

×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T=804×△A÷W

酶活定義：37℃，pH6.8 時(shí)，每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 為一個(gè)酶活單位。

SP 活性（nmol/min/10⁴ cell）=

個(gè)）

DA

e′ d

×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）)÷T=804×△A÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)

e：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1ml；V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.1ml；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/ml；V 樣總：加入提取液體積， 1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2min

注意事項(xiàng):

1. 可選用BCA 法測(cè)定蛋白含量試劑盒測(cè)定蛋白含量。

2. 樣本較多時(shí)，可以按照每個(gè)樣本試劑一：試劑二：試劑三=600：100：200（μl）的比例配制工作液，用多少配多少，臨用前立刻配制，10 分鐘內(nèi)使用。