谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性檢測試劑盒（紫外分光光度法）

谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性檢測試劑盒（紫外分光光度法）

注意：正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。

產(chǎn)品貨號：BA1119

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品簡介：

GST是一種具有多種生理功能的蛋白質(zhì)家族，主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)。GST是體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)的重要組成部分，主要催化各種化學(xué)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物與GSH的巰基共價結(jié)合，使親電化合物變?yōu)橛H水物質(zhì)，易于從膽汁或尿液中排泄，達到將體內(nèi)各種潛在或具備毒性的物質(zhì)降解并排出體外的目的。因此，GST在保護細胞免受親電子化合物的損傷中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。此外，因為GST具有GSH-Px活性，亦稱為non-Se GSH-Px，具有修復(fù)氧化破壞的大分子如DNA、蛋白質(zhì)等的功能。注意，GST催化的反應(yīng)減少GSH含量，但是不增加GSSG含量。

GST催化GSH與CDNB結(jié)合，其結(jié)合產(chǎn)物的光吸收峰波長為340nm；通過測定340nm波長處吸光度上升速率，即可計算出GST活性。

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體45mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加5mL蒸餾水溶解。

需自備的儀器和用品：

低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、紫外-可見分光光度計、1mL石英比色皿和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2、細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3、血清等液體：直接測定。

二、測定： 

1、分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到340nm，用蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二放在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）保溫。

3、空白管：取1mL石英比色皿，加入100μL試劑一，900μL試劑二和100μL試劑三，迅速混勻后于340nm測定10s 吸光度記A1，37℃水浴5min后，快速取出測定吸光度記A2。

4、測定管：取1mL石英比色皿，加入100μL上清液，900μL試劑二和100μL試劑三，迅速混勻后于340nm測定10s吸光度記A3，37℃水浴5min后，快速取出測定吸光度記A4。

三、GST活性計算： 

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1μmol CDNB與GSH結(jié)合為一個酶活性單位。

GST（U/mg prot）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×10⁶×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

=0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣品每分鐘催化1μmol CDNB與GSH結(jié)合為一個酶活性單位。

GST（U/g鮮重）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×10⁶×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每10⁴個細胞每分鐘催化1μmol CDNB與GSH結(jié)合為一個酶活單位。

GST（U/10⁴ cell）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷（ε×d）×10⁶×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1μmol CDNB與GSH結(jié)合為一個酶活單位。

GST（U/mL）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×10⁶×V反總÷V樣÷T

=0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)]

ε：產(chǎn)物摩爾消光系數(shù)，9.6×10³ L/mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；V反總：反應(yīng)體系總體積，1100μL=0.0011 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定，建議選用本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒；W ：樣品鮮量，g；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL=0.1 mL；V樣總：試劑一體積，1mL；T：反應(yīng)時間（min），5min。  

注意事項： 

1、樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力；

2、細胞中GST活性測定時，細胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細胞中GST的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞；

3、測定前先用1～2個樣做預(yù)實驗，如5min內(nèi)反應(yīng)不成線性，須對樣品用蒸餾水稀釋，計算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)；

4、若樣品測定吸光度大于1，建議對樣品用蒸餾水稀釋，計算時結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)；

5、測定反映的溫度對測定結(jié)果有影響，請控制在25℃或者37℃（哺乳動物）。