WB實(shí)驗(yàn)過程中常見條帶問題分析解決方法

WB實(shí)驗(yàn)過程中常見條帶問題分析解決方法

一、除了目的蛋白條帶外有很多條雜帶

1. 一抗抗體差異，部分不常見的分子抗體是多克隆的，雜帶比較多。

2.一抗4℃孵育過夜時(shí)，如果一抗的孵育濃度較高，也容易出現(xiàn)雜帶。 一般可按抗體說明書來設(shè)定稀釋濃度。

3.二抗孵育時(shí)間過長(zhǎng)或者二抗?jié)舛冗^高也會(huì)導(dǎo)致雜帶增多。一般二抗規(guī)定的孵育時(shí)間為室溫1-2小時(shí)， 一般1小時(shí)足矣， 時(shí)間過長(zhǎng)易出現(xiàn)非特異性條帶； 二抗一般1：10000稀釋。

4.一抗與二抗之間TBST洗膜時(shí)間較短，次數(shù)較少，常規(guī)應(yīng)該洗三次，一次10min。

5.在封閉， 或是一抗二抗孵育的這種wb中比較關(guān)鍵的步驟都會(huì)用到TBST，其配方中比較關(guān)鍵的是Tween-20，是一種非離子型表面活性劑，對(duì)抗原抗體蛋白有保護(hù)作用， 也可以減少抗體對(duì)抗原的非特異性作用， 用于洗脫未結(jié)合的抗體，減少非特異性結(jié)合， 一般用量是1ml/L。

6.一般的抗體只能識(shí)別抗原蛋白中的線性序列結(jié)構(gòu)表位即一級(jí)結(jié)構(gòu)，煮蛋白目的為打開折疊的空間結(jié)構(gòu)， 緩沖液中含有的SDS可斷裂蛋白分子內(nèi)和分子間的氫鍵， 使分子去折疊， 破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，若煮蛋白時(shí)間較短， 或者loading buffer有問題， 都會(huì)影響抗原抗體結(jié)合， 影響最后的顯影結(jié)果。對(duì)于容易形成多聚體的蛋白，可以延長(zhǎng)煮樣時(shí)間， 99℃10min。

7.有時(shí)候目的蛋白在所測(cè)蛋白樣品中是低表達(dá)蛋白，顯影后重影也較多。

8. 體內(nèi)表達(dá)的蛋白具有很多種修飾形式， 如甲基化、乙?；?、磷酸化等， 會(huì)影響結(jié)果，可以參考抗體網(wǎng)站信息及查閱文獻(xiàn)來解決。

9. 蛋白樣本降解， 也會(huì)造成雜帶過多（比原來位置低的地方出現(xiàn)主帶， 也會(huì)出現(xiàn)一些其他的帶， 所有的條帶都比正常的低且模糊不清），排除此種原因需注意在冰上裂解蛋白， 時(shí)間不要太長(zhǎng)， 裂解液中加入蛋白酶抑制劑， 定量后及時(shí)煮樣， 使其穩(wěn)定，并保存于-20℃中，煮好的樣品盡量減少在室溫中的時(shí)間。

二、WB條帶背景有黑點(diǎn)點(diǎn)

脫脂牛奶封閉時(shí)，脫脂奶粉顆粒未完全溶解。

三、WB條帶顯影無條帶

1.比較簡(jiǎn)單的原因可能是目的蛋白所出現(xiàn)的分子量位置與說明書介紹的分子量位置差距較遠(yuǎn)， 切膠時(shí)切掉了， 在第一次跑某目的蛋白時(shí)， 可采取整膜轉(zhuǎn)，看一下能否跑出條帶。當(dāng)然蛋白分子量偏高或偏低也有可能是因?yàn)檫x擇的膠的濃度與目的蛋白的濃度不對(duì)應(yīng)所致。

2.一抗的濃度較低， 可適當(dāng)增加一抗抗體濃度，或者更換效價(jià)比較高的一抗。一抗孵育的時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)， 注意不要太長(zhǎng)， 一抗蒸發(fā)會(huì)干膜。在實(shí)際操作中， 如果用透明封口袋封膜， 最后孵一抗的效果會(huì)比用孵育盒強(qiáng)， 因?yàn)榧瓤梢詼p少一抗的用量， 又可以防止膜在抗體表面漂浮， 孵育不充分， 但是要注意用封口袋封膜時(shí)， 排盡氣泡， 切不要一次封太多張膜， 膜重疊在一起也會(huì)導(dǎo)致孵育不充分。同時(shí)也要注意一抗保存要得當(dāng)，否則效價(jià)會(huì)降低。

3. 當(dāng)所測(cè)蛋白樣品中目的蛋白的含量很低時(shí)， 也會(huì)出現(xiàn)無條帶， 注意增加上樣量， 設(shè)置好陽性對(duì)照以利于結(jié)果分析， 提蛋白時(shí)也要注意操作時(shí)間， 冰上操作，在裂解液中加蛋白酶抑制劑，提的細(xì)胞或者組織樣品越新鮮越好。

4.轉(zhuǎn)膜問題。轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電壓或者電流強(qiáng)度要依據(jù)目的蛋白的分子量來設(shè)定。時(shí)間過短， 電壓過低， 沒轉(zhuǎn)上或是時(shí)間過長(zhǎng)， 電壓過高轉(zhuǎn)過了， 都會(huì)影響最后的結(jié)果?？梢宰鲱A(yù)實(shí)驗(yàn)或者根據(jù)前輩的經(jīng)驗(yàn)來設(shè)定轉(zhuǎn)膜條件。當(dāng)目的蛋白分子量過小時(shí)（10KDa），可以選擇兩張膜疊在一起轉(zhuǎn)，選用小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)膜時(shí)間。當(dāng)然， 轉(zhuǎn)膜時(shí)電極插反或者膜和膠在轉(zhuǎn)膜夾的位置擺放不正確，或者轉(zhuǎn)膜夾與轉(zhuǎn)膜芯方向不對(duì)，膜轉(zhuǎn)反了會(huì)直接導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

5.洗膜時(shí)時(shí)間過長(zhǎng)次數(shù)過多也會(huì)影響結(jié)果。

6. 發(fā)光液失效， 發(fā)光液過期或者未注意避光， 記得現(xiàn)配現(xiàn)用， 若樣品中目的蛋白表達(dá)量較低，可適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間。

7. Tween-20濃度過高時(shí)， 也會(huì)干擾抗體相互作用， 洗去PVDF膜上的目的蛋白。

8.最不應(yīng)該犯的錯(cuò)誤是一抗和二抗種屬不搭配。

四、WB條帶有邊緣規(guī)則白點(diǎn)

1. 轉(zhuǎn)膜時(shí)PVDF膜與膠之間氣泡未趕凈。轉(zhuǎn)膜過程要盡量去除氣泡， 使膜、濾紙和膠緊密結(jié)合。

2.用封口袋孵一抗時(shí)，未除凈氣泡。

五、顯影后膠片背景太高

1. 洗膜不充分。

2. 二抗?jié)舛冗^高，降低二抗?jié)舛取?/span>

3. 一抗特異性不強(qiáng)。

4. 曝光時(shí)間過長(zhǎng)，適當(dāng)減少顯影時(shí)間。

5. 封閉不充分，延長(zhǎng)封閉時(shí)間或者更換封閉液。

六、WB條帶歪斜

1. 最可能出現(xiàn)的問題是凝膠制備的問題， 灌膠時(shí)膠不平整。例如APS與TEMED加的量過多， 凝膠凝固速度過快。加完各組成成分后沒有很好地混勻， 濃度不一。灌膠后用醇類壓膠效果好于蒸餾水， 用蒸餾水壓膠后， 可輕微上下磕桌面，減小水的表面張力。在平整的桌面上配膠。配膠時(shí)室內(nèi)溫度也很重要，太低凝固時(shí)間較長(zhǎng)， 分離膠漏的較多， 膠面較低， 蛋白不能充分分離。室內(nèi)溫度過高膠凝固時(shí)間過快， 不易平整。拔梳子時(shí)要左右手用力均勻， 速度不要太快， 否則上樣孔扭曲。每個(gè)孔上樣量要一致。另外， 如果配置好的膠板有氣泡或者配膠時(shí)用的水有雜質(zhì)等不溶性顆粒，也會(huì)影響跑膠， 導(dǎo)致條帶扭曲。

2.轉(zhuǎn)膜夾老舊，海綿變薄，三明治結(jié)構(gòu)不緊湊。

3.如果整個(gè)泳道左右歪曲， 可能是上樣時(shí)多余的膠孔沒有用空的loading buffer補(bǔ)齊。

4.電泳時(shí)玻璃板未夾緊漏液，電壓不穩(wěn)，溴酚藍(lán)的線在膠上有可見扭曲。

七、條帶中央?yún)^(qū)發(fā)白

上樣過多，導(dǎo)致信號(hào)瞬間淬滅。

八、左右孔道條帶粘連

1.上樣量過多，或者分離膠與濃縮膠間有空隙。

2.由于電泳完成后沒有及時(shí)轉(zhuǎn)膜，樣品彌散。

九、顯影時(shí)出現(xiàn)不均一的背景

在一抗、二抗、封閉、或者洗膜時(shí)可能出現(xiàn)了干膜。

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