abs60237 快速內(nèi)切酶SpeI

愛必信的快速內(nèi)切酶是一系列經(jīng)過基因工程重組、能夠在5~15分鐘內(nèi)精確完成DNA切割的限制性內(nèi)切酶，適用于質(zhì)粒DNA、PCR產(chǎn)物或基因組DNA等的快速酶切。愛必信的快速內(nèi)切酶具有如下特點(diǎn)：5~15分鐘內(nèi)即可完成酶切；共用一種酶切Buffer，大大簡(jiǎn)化酶切反應(yīng)體系；良好的酶活冗余度，輕松應(yīng)對(duì)底物過量或困難模板酶切。此外，愛必信生物去磷酸化、連接試劑在配套的Buffer中具有100%活性，支持一管化反應(yīng)，提升“酶切-修飾-連接”的體驗(yàn)。
識(shí)別位點(diǎn)：
5'...A ↓ C T A G T...3'
3'...T G A T C ↑ A...5'
同裂酶：AhlI，BcuI
注：同裂酶對(duì)于不同的甲基化修飾也許具有不同敏感性。

快速內(nèi)切酶SpeI產(chǎn)品組分：

1. 快速內(nèi)切酶SpeI  DNA 快速酶切流程：
① 在冰上按如下建議的加樣順序配制反應(yīng)體系：

a. 本體系適用于經(jīng)過純化的 PCR 產(chǎn)物酶切。未純化的 PCR 產(chǎn)物具備一定的離子強(qiáng)度，10× Cut Buffer 加入量可適當(dāng)減少至 2 μl。但由于 DNA 聚合酶同時(shí)具有外切酶活性，會(huì)影響酶切產(chǎn)物，因此如下一步需進(jìn)行克隆等操作，建議酶切前對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化。
② 輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時(shí)離心以收集掛壁液滴；
③ 37℃溫育 15 min（質(zhì)粒），或 15~30 min（PCR 產(chǎn)物），或 30~60 min（基因組 DNA）；
④ 80℃溫育 20 min 即可使酶失活，停止反應(yīng)（可選）。
2. 雙酶切或多酶切：
① 每種快速內(nèi)切酶的用量為 1 μl，并根據(jù)需要適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體系；
② 所有快速內(nèi)切酶的體積總和不得超過總反應(yīng)體系的 1/10；
③ 如果所用的幾種快速內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同，應(yīng)先以最適溫度低的酶開始酶切，再添加最適溫度較高的酶，在其最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶切反應(yīng)。
3. 適用于質(zhì)粒的擴(kuò)大反應(yīng)體系：
注：如果總反應(yīng)體系大于 20 μl，應(yīng)適當(dāng)增加溫育時(shí)間，盡量使用水浴、金屬浴或沙浴。
不同 DNA 中的酶切位點(diǎn)數(shù)量：

甲基化修飾影響：

在不同反應(yīng)緩沖液中的活性：

-20℃，有效期2年。

建議反應(yīng)條件：
1× Cut 緩沖液；
37℃溫育；
參照“DNA 快速酶切流程”配制反應(yīng)體系。
失活條件：
80℃溫育 20 min。
質(zhì)量控制：
功能活性檢測(cè)：
最適反應(yīng)溫度下，在 20 μl 反應(yīng)體系中，1 μl SpeI 能夠在 15 min 內(nèi)*消化 1 μg pUC19-SpeI DNA。
超長(zhǎng)時(shí)間溫育檢測(cè)：
最適反應(yīng)溫度下，將 1 μl SpeI 與 1 μg pUC19-SpeI DNA 共同溫育 3 h，未檢測(cè)到其他核酸酶污染或星號(hào)活性引起的底物非特異性降解，延時(shí)酶切可能出現(xiàn)星號(hào)活性。
酶切 - 連接 - 再酶切檢測(cè)：
最適反應(yīng)溫度下，使用 1 μl SpeI 消化底物，回收酶切產(chǎn)物。在 22℃下使用適量 T4 DNA Ligase(Fast) 可以將酶切產(chǎn)物重新連接。將連接產(chǎn)物再次回收后，使用相同的內(nèi)切酶可以重新切開連接產(chǎn)物。
非特異性內(nèi)切酶活性檢測(cè)：
最適反應(yīng)溫度下，將 1 μl SpeI 與 1 μg 超螺旋質(zhì)粒DNA 共同溫育 4 h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，質(zhì)粒 DNA 仍然處于超螺旋狀態(tài)。
藍(lán)白斑檢測(cè)：
將含有單一 lacZα 基因的載體以 1 μl SpeI 消化，重新連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有對(duì)應(yīng)抗生素、IPTG和 X-gal 的 LB 培養(yǎng)基平板上。連接正確的產(chǎn)物會(huì)生長(zhǎng)出藍(lán)色菌落，而連接錯(cuò)誤（即 DNA 末端切口不完整）的產(chǎn)物將得到白色菌落。對(duì)于愛必信的系列限制酶而言，白色菌落比例應(yīng)小于 1%。