原核蛋白表達技術(shù)服務(wù)

服務(wù)簡介

細菌表達系統(tǒng)是一種比較理想的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)，它是生產(chǎn)重組蛋白和抗體的優(yōu)先選擇，而且許多細菌已經(jīng)被很好地研究利用。原核蛋白表達系統(tǒng)是常用的表達系統(tǒng)，在大量細菌中，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌細胞系是常用的重組蛋白表達宿主，具有遺傳背景清楚、成本低、表達量高和表達產(chǎn)物分離純化相對簡單等優(yōu)點。

大腸桿菌和枯草芽孢桿菌可以在適宜條件下以很低的成本快速復(fù)制，而且表達水平高，這種特性使其成為大規(guī)模生產(chǎn)的有效和經(jīng)濟的方式。此外，他們的基因組已*測序。另外，由于結(jié)構(gòu)簡單，細菌比真核生物更容易轉(zhuǎn)染。這些優(yōu)勢特征使表達過程更容易和更快速。

但在某些方面，原核蛋白表達系統(tǒng)也有其局限性。雖然，可以利用細菌比較容易地表達具有少量修飾的蛋白質(zhì)，但需要考慮到細菌中沒有細胞核，高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。而這些結(jié)構(gòu)在細胞運輸和翻譯后修飾（PTM）過程中是必需的。因此，細菌表達系統(tǒng)不能表達膜結(jié)合蛋白，例如胰島素受體、血型糖蛋白以及某些酶等。由于很多蛋白質(zhì)在正確折疊中需要這種修飾，而細菌無法完成修飾，導(dǎo)致細菌中產(chǎn)生的很多蛋白質(zhì)是無活性的并且不起作用。由此看來，客戶必須根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性選擇合適的蛋白表達系統(tǒng)。

服務(wù)內(nèi)容 

百歐泰生物具有多種表達宿主菌，客戶可以根據(jù)實際需要，選用不同融合標(biāo)簽蛋白、不同抗性、不同作用元件的表達載體和不同性質(zhì)的表達宿主。本公司可提供的服務(wù)包括以下幾類，客戶可以提供目的基因序列或建好的表達質(zhì)粒，本公司提供一站式基因合成和蛋白表達與純化服務(wù)或重組蛋白表達與純化服務(wù)。

實驗原理

在原核蛋白表達體系中，外源基因通常需要誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)才能進行表達，以E.coli（大腸桿菌表達系統(tǒng)）為例，使用誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達原理如下：

原核生物絕大多數(shù)的基因按功能相關(guān)性成簇地排列，且密集于染色體上，共同形成一個轉(zhuǎn)錄單位——操縱子，也稱基因表達的協(xié)同單位。E.coli的乳糖操縱子含Z、Y、A三個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和乙?；D(zhuǎn)移酶（transacetylase)；此外還有調(diào)控基因：操縱序列O（operator）、啟動+序列P（promoter）；而I(編碼Lac阻遏物，Lac repressor)不屬于乳糖操縱子。

Lac阻遏物是一種具有4個相同亞基的四級結(jié)構(gòu)蛋白，都有一個與誘導(dǎo)劑結(jié)合的位點。在沒有乳糖存在時，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)，Lac阻遏物（即阻遏蛋白）能與操縱基因O結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，阻止了轉(zhuǎn)錄的路徑，從而抑制轉(zhuǎn)錄啟動。而當(dāng)有誘導(dǎo)劑（這里指IPTG）存在時，誘導(dǎo)劑可與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致阻遏物從操縱基因O上解離下來，RNA聚合酶不再受阻礙，啟動子P開始發(fā)生轉(zhuǎn)錄，啟動反應(yīng)開始發(fā)生轉(zhuǎn)錄。

在這個操縱子（元）體系中，真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞，經(jīng)β-半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘恰瓷砩系恼T導(dǎo)劑。而在實驗中，通常選用異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作為誘導(dǎo)劑，IPTG是一種作用很強的誘導(dǎo)劑，不被細菌代謝且十分穩(wěn)定，因此實驗室使用較多。

實驗步驟

測序驗證

序列比對

重組質(zhì)粒酶切

蛋白表達分析鑒定（11度低溫誘導(dǎo)體系）

重組蛋白親和純化（Ni親和樹脂一步親和純化）

純化后蛋白Sumo蛋白酶酶切

Sumo蛋白酶酶切后第二次親和純化

得到酶切后目的蛋白

實驗服務(wù)流程

雙方溝通一致后確定實驗方案，確定服務(wù)要求-簽訂合同—預(yù)付款-開始實驗-成果交付

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