酵母表達(dá)技術(shù)服務(wù)/真核蛋白表達(dá)

服務(wù)簡(jiǎn)介

酵母是一種單細(xì)胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長(zhǎng)繁殖速度迅速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達(dá)基因工程產(chǎn)品時(shí)，酵母具有與其他真核生物類似的蛋白質(zhì)分泌途徑，外源基因的分泌表達(dá)，不僅方便了表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，同時(shí)也和表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后加工有關(guān)。酵母表達(dá)系統(tǒng)由于兼具原核以及真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，因此利用此系統(tǒng)可高水平表達(dá)蛋白。常用的表達(dá)系統(tǒng)有釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)和甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)，而甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)較為常見，以畢赤酵母屬(Pichia)應(yīng)用較多。

釀酒酵母(Saecharomycescerevisiae)被認(rèn)為是安全性生物，不產(chǎn)生毒素，但釀酒酵母難于高密度培養(yǎng)，分泌效率低，幾乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白質(zhì)，也不能使所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)正確糖基化，而且表達(dá)蛋白質(zhì)的C端往往被截短。因此，一般不用釀酒酵母做重組蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主菌。甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用較多，甲醇酵母主要有漢森酵母屬(Hansenula)，畢赤酵母屬(Pichia)，球擬酵母屬(Torulopsis)等，并以畢赤酵母屬(Pichia)應(yīng)用為主。利用甲醇酵母表達(dá)外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達(dá)克級(jí)，與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動(dòng)物細(xì)胞，不會(huì)發(fā)生超糖基化。

酵母表達(dá)系統(tǒng)是研究真核蛋白質(zhì)表達(dá)和分析的有力工具，一是含有*的強(qiáng)有力的AOX (醇氧化酶基因)啟動(dòng)子,用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)。二是培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離，畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基成本合理，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，期為無機(jī)鹽，培養(yǎng)基中不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品分離純化。三是外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定，外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，不易丟失并能得到高表達(dá)菌株。四是作為真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化、脂肪?；?、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能。

服務(wù)內(nèi)容

百歐泰生物的酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)采用的宿主是巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)，該表達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展迅速、應(yīng)用較多的一種真核表達(dá)系統(tǒng)。百歐泰生物酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)服務(wù)項(xiàng)目包括：

①重組酵母表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建；

②重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化；

③重組表達(dá)子篩選；

④小規(guī)模蛋白表達(dá)和純化（24培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)物）。

實(shí)驗(yàn)原理

以巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因?yàn)槔?，畢赤酵母中含有兩個(gè)乙醇氧化酶（Alcohol oxidase, AOX）分別編碼基因AOX1和AOX2，兩種序列相似。AOX1基因嚴(yán)格受甲醇誘導(dǎo)和調(diào)控。當(dāng)甲醇為碳源時(shí)，AOX1啟動(dòng)子可被甲醇誘導(dǎo)，啟動(dòng)乙醇氧化酶的表達(dá)，從而用甲醇進(jìn)行代謝。甲醇酵母的表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，很容易整合到酵母基因組中，大部分甲醇酵母的表達(dá)載體（質(zhì)粒）中都有甲醇酵母醇氧化酶基因（AOX1），在該基因啟動(dòng)子(PAOX1)作用下，質(zhì)?？捎脕泶龠M(jìn)編碼外源蛋白的目的基因的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)流程

?將目的基因克隆入畢赤酵母表達(dá)載體，收獲陽性重組表達(dá)質(zhì)粒；

?用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化陽性重組質(zhì)粒，使之線性化；

?將線性化的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人巴斯德畢赤酵母菌株（如GS1 15，KM71）；

?將轉(zhuǎn)化物接種HIS4缺陷平板進(jìn)行初次篩選；

?用不同濃度的G418平板進(jìn)行第二輪篩選；

?挑選10~20個(gè)克隆進(jìn)行小規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)，鑒定外源基因的表達(dá)量；

?挑選高水平表達(dá)菌株進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)以制備外源基因的表達(dá)蛋白質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)服務(wù)流程

雙方溝通一致后確定實(shí)驗(yàn)方案，確定服務(wù)要求-簽訂合同—預(yù)付款-開始實(shí)驗(yàn)-成果交付

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