CE-SDS蛋白檢測(cè)

　　蛋白質(zhì)的分子大小變異體檢測(cè)是蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程中至關(guān)重要的檢測(cè)指標(biāo),CE-SDS法檢測(cè)廣泛應(yīng)用在包括單抗在內(nèi)的各種蛋白質(zhì)純度檢測(cè)中。CE-SDS蛋白檢測(cè)是經(jīng)過驗(yàn)證的靈敏度、準(zhǔn)確度、性價(jià)比、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更高的國產(chǎn)化新型檢測(cè)試劑盒。試劑盒中包含優(yōu)化的SDS樣品緩沖液A(PH=9.0)SDS樣品緩沖液B(PH=6.5)[1]涂層毛細(xì)管、優(yōu)化的凝膠緩沖液(保密配方)、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品、酸堿沖洗液等試劑及耗材。經(jīng)過驗(yàn)證,試劑盒可廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)還原及非還原CE-SDS純度檢測(cè),并且可在市面上常見毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中使用。

　　[試劑盒成分信息]

　　產(chǎn)品信息

　　CE-SDS蛋白檢測(cè)的注意:凝膠緩沖液或者SDS樣品緩沖液在使用之前,若注意到試劑瓶底部有沉淀,需室溫?cái)嚢杌蛘叱暡ǔ曋敝猎噭┢恐芯彌_液wanquan溶解后方可使用。在吸取緩沖液進(jìn)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)進(jìn)樣之前,緩沖液需保證在室溫中放置至少4小時(shí)。

　　1.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品信息

　　蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品包含14.3,29.0,44.2,55.0,6.4,105及150KD的蛋白質(zhì),用CE-MW蛋白質(zhì)分子量測(cè)定實(shí)驗(yàn),該產(chǎn)品不包括在試劑盒中,需單獨(dú)采購。

　　2.內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品信息

　　14.3KDa的蛋白質(zhì)作為遷移標(biāo)記物,用于蛋白樣品相對(duì)于內(nèi)標(biāo)的相對(duì)遷移來計(jì)算分子量,可獲得更準(zhǔn)確的分子量結(jié)果和鑒定信息。另外,內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品可作為常規(guī)蛋白純度檢測(cè)內(nèi)標(biāo),用于校準(zhǔn)出峰時(shí)間。

　　試劑盒儲(chǔ)存條件

　　[樣品處理]

　　1.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品制備

　　(1)非還原模式

　　用樣品緩沖液溶解稀釋蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品,使蛋白的終濃度0.2-2mg/ml之間,總體積95ul。加入5ulN-乙基馬來酷亞胺(NEM)溶液。蓋好瓶蓋,用封口膜封好,并充分混勻，離心機(jī)6000rpm離心至少1分鐘。70°C水浴10分鐘。室溫冷卻至少3分鐘,離心機(jī)6000rpm離心至少1分鐘。轉(zhuǎn)移95ul制備好的樣品至內(nèi)插管中,內(nèi)插管放入進(jìn)樣瓶中,蓋好進(jìn)樣瓶蓋子。

　　(2)還原模式

　　用樣品緩沖液溶解稀釋蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品,使蛋白的終濃度在0.2-2.0mg/mL之間,總體積為95uL。加入5ul2-琉基乙醇,蓋上瓶蓋,用封口膜封好,并充分混勻,離心6000rpm離心至少1分鐘。70°C水浴10分鐘。室溫冷卻至少3分鐘,離心機(jī)6000rpm離心至少1分鐘。轉(zhuǎn)移95ul制備好的樣品至內(nèi)插管中,內(nèi)插管放入進(jìn)樣瓶中,蓋好進(jìn)樣瓶蓋子。

　　2.蛋白樣品預(yù)處理

　　蛋白樣品的脫鹽:信號(hào)強(qiáng)度和分離度對(duì)于蛋白中鹽的濃度十分敏感,如果蛋白樣品濃度低于10mg/ml并且緩沖液鹽的終濃度高于50mM,樣品的進(jìn)樣效率就會(huì)降低以下是使用超濾法對(duì)樣品的脫鹽步驟。

　　向超濾離心管中加入1mL蛋白樣品,再加入1mLSDS樣品緩沖液。7000g離心20min。再加入2 mL樣品緩沖液,7000 g離心20 min。上下顛倒超濾離心管使上層溶濃在濾膜作用下濾到新的小瓶中,并在5000g下離心3min。將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到樣品管中,加入樣品緩沖液使終量為1mL。

　　3.蛋白樣品的濃度

　　保證在加入SDS樣品緩沖液后,蛋白的濃度在0.2-2.0mg/mL之間,推薦最佳蛋白濃度為1mg/mL。如果蛋白濃度過高,與蛋白結(jié)合的SDS就會(huì)不足,導(dǎo)致峰變寬而且分辨率降低;如果蛋白濃度過低,信號(hào)就會(huì)相應(yīng)變低。

　　4.非還原樣品處理

　　對(duì)比一個(gè)蛋白的還原和非還原狀態(tài)可以得到一些結(jié)構(gòu)信息，通過烷基化蛋白樣品口以減少由于蛋白自動(dòng)還原產(chǎn)生的蛋白異質(zhì)性。以下是配制非還原蛋白樣品的過程

　　(1)烷基化試劑的制備

　　使用100mM N-乙基馬來酷亞胺(NEM)或800 mM碘酷胺(AM)作為烷基化試劑[2]3.加入蛋白質(zhì)和分析樣品中后分別稀釋20倍至終濃度5 mM或40 mM。

　　a)稱取12.5mgNEM或148mglAM置于1.5mL離心管中。

　　b)加入1000ul超純水,蓋好瓶蓋并充分混合并標(biāo)記。2-8°C避光保存,有效期5天

　　(2)樣品的制備

　　用樣品緩沖液溶解稀釋樣品,使蛋白的終濃度0.2-2mg/ml之間,總體積95ul。加入2ul的內(nèi)標(biāo)。加入5ulN-乙基馬來酷亞胺(NEM)溶液。蓋好瓶蓋,用封口膜封好,并充分混勻,離心機(jī)6000rpm離心至少1分鐘。70°C水浴10分鐘。室溫冷卻至少3分鐘,離心機(jī)6000rpm離心至少1分鐘。轉(zhuǎn)移95ul制備好的樣品至內(nèi)插管中,內(nèi)插管放入進(jìn)樣瓶中,蓋好進(jìn)樣瓶蓋子。

　　5.還原樣品處理

　　用樣品緩沖液溶解稀釋樣品,使蛋白的終濃度在0.2-2.0mg/mL之間,總體積為95uL加入2ul的內(nèi)標(biāo)。加入5ul2-琉基乙醇,蓋上瓶蓋,用封口膜封好,并充分混勻,離心機(jī)6000rpm離心至少1分鐘。70°C水浴10分鐘。室溫冷卻至少3分鐘,離心機(jī)6000rpm離心至少1分鐘。轉(zhuǎn)移95ul制備好的樣品至內(nèi)插管中,內(nèi)插管放入進(jìn)樣瓶中,蓋好進(jìn)樣瓶蓋子。

　　[溫馨提示]

　　巰基乙醇相關(guān)操作應(yīng)在通風(fēng)櫥操作

　　本試劑盒相關(guān)操作需使用超純水

　　樣品緩沖液A(PH=9.0)是參考2015版藥典],已有項(xiàng)目的檢測(cè)方法未發(fā)生變更,建議使用樣品緩沖液A。樣品緩沖液B(PH=6.5)是參考2020版藥典[5],根據(jù)報(bào)道[6],蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理時(shí)在高溫高堿條件下,蛋白質(zhì)更易產(chǎn)生異常碎片,影響非還原CE-SDS實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度。新項(xiàng)目的檢測(cè)方法,方法開發(fā)階段,建議使用樣品緩沖液B。

　　[毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)運(yùn)行]

　　1.毛管電泳儀Beckman Pa800,Agilent 7100Maurice等

　　2.基本條件設(shè)置樣品盤溫度:10士2°C；毛細(xì)管溫度:20士2°C。

　　3.毛細(xì)管預(yù)處理堿沖洗液在60psi壓力下沖洗3分鐘,然后用酸沖洗液60psi壓力下沖洗2分鐘。最后用超純水在70psi壓力下沖洗1分鐘,在每次樣品運(yùn)行前都應(yīng)進(jìn)行該步驟。

　　4.凝膠緩沖液預(yù)填充凝膠緩沖液在50psi壓力下沖洗15分鐘,每次樣品運(yùn)行前都應(yīng)該進(jìn)行該步驟

　　5.樣品進(jìn)樣正端進(jìn)樣:-5KV,20S、反端進(jìn)樣:5KV,20S

　　6.樣品分離

　　正端分離:電壓-15KV分離時(shí)間40分鐘,

　　反端分離:電壓15KV分離時(shí)間15分鐘。