XSL0024 Trap染色

抗酒石酸酸性磷酸酶染色,又稱Trap染色，是用于檢測骨、骨細(xì)胞中破骨細(xì)胞的染色，使破骨細(xì)胞呈紅色，細(xì)胞核淺藍(lán)色， 用以顯示破骨細(xì)胞的分布及數(shù)量變化。

Trap染色是用于檢測骨組織、骨細(xì)胞中特征物質(zhì)的染色，使破骨細(xì)胞呈紅色，背景呈綠色或藍(lán)色?？咕剖崴嵝粤姿崦?（Trap）為破骨細(xì)胞的標(biāo)志酶，特異地分布于破骨細(xì)胞中，為破骨細(xì)胞所有，通常作為鑒別破骨細(xì)胞的重要標(biāo)志物。在含 酒石酸的酸性條件下，trap能將萘酚AS-BI磷酸鹽水解，產(chǎn)生的萘酚AS-BI立即與fast red或六偶氮副品紅結(jié)合，在酶活性部 位形成不溶性的紅色染料，通過觀察紅色染料的形成可間接了解酸性磷酸酶的活性，進(jìn)一步鑒別及分析破骨細(xì)胞的狀態(tài)。

骨組織切片及trap染色實(shí)驗(yàn)步驟

1、 骨組織脫鈣：新鮮骨組織固定于4%多聚jia醛24h以上。將組織從固定液取出置于EDTA脫鈣液內(nèi)脫鈣（不能用含酸的脫 鈣液脫鈣），每3天換一次脫鈣液，至骨組織針扎可以順利通過為止。

2、 取材：在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)dang將目的部位組織修平整，將修切好的組織和對應(yīng)的標(biāo)簽放于脫水盒內(nèi)。

3、 脫水：將脫水盒放進(jìn)吊籃里于脫水機(jī)內(nèi)依次梯度酒精進(jìn)行脫水。75%酒精4h-85%酒精2h-90%酒精2h-95%酒精1h-無水 乙醇I 30min-無水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蠟I 1h-蠟II 1h-蠟III 1h。 4、 包埋：將浸好蠟的組織于包埋ji內(nèi)進(jìn)行包埋。先將融化的蠟放入包埋框，待蠟?zāi)讨皩⒔M織從脫水盒內(nèi)取出按照包埋 面的要求放入包埋框并貼上對應(yīng)的標(biāo)簽。于-20°凍臺冷卻，蠟?zāi)毯髮⑾瀴K從包埋框中取出并修整蠟塊。

4、 切片：將修整好的蠟塊置于石蠟切片機(jī)上切片，片厚4μm。 切片漂浮于攤片機(jī)40℃ 溫水上將組織展平，用載玻片將組 織撈起，并放進(jìn)60℃ 烘箱內(nèi)烤片。待水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆谩?

5、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-無水乙醇Ⅰ10min-無水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗。

6、 染液配制：A液：0.1mol/L醋酸緩沖液PH5.0：醋酸Na1.3608g+蒸餾水100ml溶解，用Bing醋酸調(diào)PH值到5.0。B液：六 偶氮副品紅 4%亞肖酸Na：2g亞肖酸Na+去離子水50ml 副品紅溶液：副品紅2.5g+去離子水50ml+濃鹽酸7.5ml，加熱至90°溶解后過濾，4°棕色瓶保存。臨用前4%亞肖酸Na與副品 紅溶液等比例混合。 C液：萘酚AS-BI磷酸酯20mg+N,N-2甲基甲酰胺1ml溶解。 孵育液配制：A液18ml+B液1ml+C液1ml混勻，用1M NaOH或1M鹽酸調(diào)pH至5.0，再加酒石酸鉀Na0.282g，充分溶解過濾 后備用即為TRAP孵育液。

7、 染色：切片置于TRAP孵育液內(nèi)37°孵育50min，鏡下觀察破骨細(xì)胞呈酒紅色為止。蒸餾水漂洗。

8.蘇木素染細(xì)胞：切片入Harris蘇木染3-8min,自然水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自然水沖洗，0.6%氨.水返藍(lán)，流水沖洗。

9.脫水封片：將切片依次放入95%酒精l 5min-95%無水乙醇II5min-二甲苯I5min-二甲苯II5min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。

10.顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。染色結(jié)果：破骨細(xì)胞胞漿呈酒紅色，核藍(lán)色。

注意事項(xiàng)

1、試劑配制的過程中，各個(gè)試劑的PH值一定要準(zhǔn)確，PH不準(zhǔn)會(huì)導(dǎo)致酶不能被有效激活，導(dǎo)致染色結(jié)果不佳。

2、亞硝酸Na溶液不穩(wěn)定，容易被氧化，在使用時(shí)避免帶入雜質(zhì)，并且為了確保染色結(jié)果，盡量一到兩個(gè)星期更換一次。

3、染trap的骨組織好用EDTA脫鈣，用酸脫鈣的組織切片trap為陰性。

結(jié)果展示

結(jié)果判讀：

破骨細(xì)胞呈酒紅色或淺紅色，細(xì)胞核呈淺藍(lán)色

送樣運(yùn)輸要求：

1. 樣本放置于20倍樣本體積的固定液中固定24h以上，常溫運(yùn)輸送樣。切勿固定時(shí)間過長，切勿冷凍結(jié)冰。

2. 石蠟切片常溫運(yùn)輸。

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