XSL0039 堿性磷酸酶染色

堿性磷酸酶染色

實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介：

堿性磷酸酶（AKP）的顯示方法早由Gomeri（1939） 提出，現(xiàn)在這種方法稱(chēng)為Gomeri法。堿性磷酸酶是指磷酸單酯酶 Ⅰ，它能在pH8.6~10.0的適合條件下分解磷酸單酯，對(duì)于與磷酸相接的醇基沒(méi)有特異性，Gomeri法是讓該酶在堿性條件 下，分解甘油磷酸Na，產(chǎn)生磷酸根。

實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理：

在一定條件下，使細(xì)胞中的酶作用于酶的底物，使其產(chǎn)物在原地進(jìn)行捕捉、沉淀轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物。細(xì)胞組織中的堿性磷酸 酶在堿性（PH9.0－9.6）環(huán)境下使作用液中的底物（a一磷酸萘酚鈉）水解，產(chǎn)生出a萘酚，然后再與偶氮鹽偶聯(lián)，生成不 溶性的耐曬染料（最終產(chǎn)物的顏色因所用偶氮鹽的品種不同而有所不同）。

實(shí)驗(yàn)操作流程：

1、取材、 固定、包埋、切片；

2、取已粘好烘 干的切片兩塊，放入二甲苯（一）→二甲苯（二）（各3-4分鐘）的染缸中進(jìn)行脫蠟，再經(jīng)100 %乙醇（一） →100 %乙醇（二）→95%乙醇→90%乙醇 →70%乙醇→30%乙醇→水。每級(jí)各一分鐘，在移切片時(shí)，用鑷子夾住切片震蕩 并提起，放下反復(fù)幾次，在移入下一染缸邊緣前稍停留，讓溶液滴凈后，再入下 一染缸，以免把上一染缸溶液過(guò)多帶入下 一染缸，而影響切片質(zhì)量；

3、將其中一塊切片以蠟筆作一標(biāo)記（用作對(duì)照組切片），放入沸水中煮沸5分鐘；

4、將兩塊切片均放入AKP作用液中孵育30-60分鐘，作用液要事先預(yù)熱到37°C，水浴中進(jìn)行；

5、取出切片在蒸餾水中洗滌；

6、放入硝.酸.鈷溶液2-3分鐘；

7、蒸餾水沖洗干凈，否則切片易被污染，影響定位；

8、切片浸入硫化銨中2-3分鐘；

9、蒸餾水沖洗干凈；

10、經(jīng)各級(jí)酒精脫水。即30%乙醇→70%乙醇→90%乙醇→950%乙醇→100 %乙醇（二）→100 %乙醇（一），各級(jí)一分鐘。 在顯微鏡下觀察，細(xì)胞中有黑色沉淀存在的地方，就表明有酶的存在。煮沸的對(duì)照切片無(wú)黑色沉淀。

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