熒光素酶報告基因

一、應(yīng)用原理

轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式作用元件實現(xiàn)共價結(jié)合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。熒光素酶報告基因實驗（luciferase assay）是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異順序結(jié)合的重要手段。

其原理簡述如下：

（1）構(gòu)建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。

（2） 將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞或其它相關(guān)的細胞系。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度成正比。

（3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。

二、技術(shù)流程

（1） 用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。

（2）設(shè)計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒（pGL3-basic）中。

（3）篩選陽性克隆，測序。擴增克隆并提純質(zhì)粒備用。

（4） 擴增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒，提純備用。同時準備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對照，提純備用。

（5） 培養(yǎng)293（或其它目的細胞），并接種于24孔板中，生長10-24小時（80%匯合度）。

（6） 將報告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞。

（7）提取蛋白并用于熒光素酶檢測。

（8） 加入底物，測定熒光素酶的活性。

（9） 計算相對熒光強度，并與空載對照比較。