Nav1.7-GFP HEK293細(xì)胞系

穩(wěn)定重組HEK293細(xì)胞系，工程化設(shè)計(jì)用于多X環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)人類Nav1.7（Genbank #Q15858），在C末端融合綠色熒光蛋白[激發(fā)約395 nm，475 nm；發(fā)射約510 nm]，并帶有C末端鏈球菌素結(jié)合肽（SBP）融合。Nav1.7是一種河T毒素敏感的電壓門控鈉通道IX亞型α亞基（SCN9A）。

Nav1.7是一種電壓門控鈉離子通道，由人類SCN9A基因編碼。它通常在兩種類型的神經(jīng)元中高水平表達(dá)：背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)的傷害感受神經(jīng)元，以及交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，這些是自主（不自主）神經(jīng)系統(tǒng)的一部分。

Nav1.7存在于痛覺感覺神經(jīng)末梢，即傷害感受器附近，接近沖動(dòng)發(fā)起區(qū)域。Nav1.7通道產(chǎn)生快速激活和失活的電流，對(duì)河T毒素水平敏感。缺乏傷害感受器中Nav1.7的敲除小鼠顯示出對(duì)炎癥性疼痛反應(yīng)減少[1]。

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應(yīng)用

? 藥物化合物篩選

? 功能測(cè)定

細(xì)胞培養(yǎng)協(xié)議

細(xì)胞解凍

1. 在37°C水浴中搖晃裝有冷凍細(xì)胞的小瓶大約60秒。細(xì)胞解凍后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將小瓶的全部?jī)?nèi)容轉(zhuǎn)移到含有10 ml預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基4（無Blasticidin或Zeocin）的試管中。在37°C水浴中放置細(xì)胞過久將導(dǎo)致活性迅速喪失。

2. 立即以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞在5 ml預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基4（無Blasticidin或Zeocin）中重懸。

3. 將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25或T75培養(yǎng)瓶中，并在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng)24小時(shí)后，檢查細(xì)胞附著和活性。更換培養(yǎng)基為新鮮的解凍培養(yǎng)基4（無Blasticidin或Zeocin），并繼續(xù)在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細(xì)胞準(zhǔn)備好傳代。

5. 細(xì)胞應(yīng)在w全融合前傳代。在s次傳代及后續(xù)傳代中，使用生長培養(yǎng)基4A（含Blasticidin和Zeocin）。

細(xì)胞傳代

1. 抽去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞，并用0.05% Y酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長培養(yǎng)基4A并轉(zhuǎn)移到試管中。以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞在不含Blasticidin和Zeocin的生長培養(yǎng)基4A中重懸。按照每周1:10至1:15的期望亞培養(yǎng)比例，將細(xì)胞種入新的培養(yǎng)容器中。

細(xì)胞冷凍

1. 抽去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞，并用0.05% Y酶/EDTA從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長培養(yǎng)基4A并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

3. 以300 x g的速度離心細(xì)胞5分鐘，去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞在4°C冷凍培養(yǎng)基（BPS Bioscience #79796，或10% DMSO + 90% FBS）中重懸，細(xì)胞濃度約為2 x 10^6個(gè)細(xì)胞/ml。

4. 將1 ml的細(xì)胞懸浮液分裝到冷凍小瓶中。將小瓶放入保溫容器中緩慢冷卻，并在-80°C下保存過夜。

5. 次日將小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中保存。

注意：建議在早期傳代時(shí)擴(kuò)增細(xì)胞并至少冷凍10個(gè)小瓶以備將來使用。

目標(biāo)蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)

為了表達(dá)Nav1.7，細(xì)胞在收獲或測(cè)定前24小時(shí)用DMEM/F12 50/50補(bǔ)充10% FBS、1%青M素/鏈M素、1 ?g/ml多X環(huán)素（Biochemika #44577）和3 mM丁酸鈉（Acros Organics #263190250）誘導(dǎo)。

圖1. 表達(dá)Nav1.7的細(xì)胞的Western Blot。

使用抗鈉通道Nav1.7，克隆N68/6（Millipore #MABN41）染色的HEK293 Nav1.7細(xì)胞的Western Blot，隨后使用堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG（Rockland Immunochemicals #610-1502）。M：分子量標(biāo)記。

文獻(xiàn)參考：

1. Catterall, W.A. Cell and Developmental Biology 16: 521–555 (2000).

2. Choi, J.S., et al. Neurology 67:1563-1567 (2006).

3. Li, Y., el al. Protein Science 20 (1): 140–149 (2011).

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認(rèn)證的生命科學(xué)領(lǐng)域的供應(yīng)商，公司一直致力于開發(fā)藥物研發(fā)領(lǐng)域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領(lǐng)域的創(chuàng)新解決方案，以推動(dòng)新的藥物發(fā)現(xiàn)。公司主要關(guān)注的領(lǐng)域包括免疫療法、表觀遺傳學(xué)、CRISPR、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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