石蠟冰凍切片TUNEL凋亡熒光

一、石蠟冰凍切片TUNEL凋亡熒光實驗原理：

dUTP缺口末端標記(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL) 法檢測細胞凋亡的原理是當細胞發(fā)生凋亡時,DNA內(nèi)切酶被激活，核小體間的基因組DNA被切斷，暴露的3-0H可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TerminalDeoxynucleotidyl Transferase, TdT)加上帶有熒光素FITC標記的dUTP,從而可以通過熒光顯微鏡進行檢測。

二、石蠟冰凍切片TUNEL凋亡熒光實驗意義：

1.TUNEL法是一種分子生物學與形態(tài)學相結(jié)合的研究方法，可對完整的單個凋亡細胞或者凋亡小體進行原位染色，可以準確反映細胞凋亡典型的生物化學和形態(tài)特征。

2.可用于石蠟切片、冰凍切片、培養(yǎng)的細胞等進行細胞凋亡檢測，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學方法要高。

3.操作簡便快捷，在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。

三、TUNEL凋亡熒光實驗步驟:

1.石蠟切片TUNEL顯色法:

①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，脫蠟劑= =甲苯，至水劑乙醇;

②PBS漂洗3*5 min; .

③加入蛋白酶K工作液379C反應15-30 min, PBS漂洗3x5 min;

④4%多聚甲醛(pH7 4的PBS)室溫固定15-30 min, PBS漂洗3x5 min;

⑤浸入封閉液(3%H202)室溫封閉10 min, PBS漂洗3x5 min;

⑥參考使用試劑盒的說明書配制適量的TUNEL檢測液，其中含有TdT酶、熒光標記液、TUNEL檢測液;

⑦樣品上加入適量TUNEL檢測液，37°C避光孵育60 min, PBS漂洗3x5 min;

⑧選擇是否用DAPI復染細胞核;

⑨使用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下進行觀察。

2.冰凍切片TUNEL顯色法:

①新鮮組織經(jīng)處理后，立即在恒冷冰凍切片機內(nèi)切片，厚度為5~6 um;

②防脫玻片，貼片，室溫陰干約12h;③4%多聚甲醛(pH7 .4的PBS)室溫固定10 min,

PBS漂洗3x5 min;

④浸入封閉液(3%H20O2) 室溫封閉10 min, PBS漂洗3x5 min;

⑤浸入通透液(0.1%Triton X-100溶于PBS中)，室溫通透30 S-2 min;

⑥參考使用試劑盒的說明書配制適量的TUNEL檢測液，其中含有TdT酶、熒光標記液、TUNEL檢測液;

⑦樣品上加入適量TUNEL檢測液，37°C避光孵育60 min, PBS漂洗3x5 min;

⑧選擇是否用DAPI復染細胞核:

⑨使用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下進行觀察。

四、結(jié)果展示

實驗完成周期及交付標準

1.實驗周期: 1-2周

2.交付標準:蠟塊、切片、染色圖片.實驗報告(實驗步驟、試劑、耗材等)

需確認的信息

1.樣本的種屬

2.樣本的類型(固定的組織or蠟塊or切片)

3.是否提供試劑盒

4.拍照要求

實驗代做服務：