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目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-常量法>>三羧酸循環(huán)系列>> 三磷酸循環(huán)系列試劑盒 一管式點突變試劑盒

三磷酸循環(huán)系列試劑盒 一管式點突變試劑盒
  • 三磷酸循環(huán)系列試劑盒 一管式點突變試劑盒
參考價 面議
具體成交價以合同協(xié)議為準
參考價 面議
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  • 品牌 SOLARBIO/索萊寶
  • 型號
  • 廠商性質(zhì) 生產(chǎn)商
  • 產(chǎn)品資料 查看pdf文檔
  • 所在地 北京市
屬性

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更新時間:2024-07-29 15:15:10瀏覽次數(shù):1475評價

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三磷酸循環(huán)系列試劑盒 一管式點突變試劑盒
傳統(tǒng)的方法需要使用單鏈 DNA 模板,而得到單鏈 DNA 模板又需要先將基因克隆到類似 M13 這種載體中,操作過程冗長。為了克服這些缺點,本公司將突變位點設計到一對互補的引物中,用高保真擴增質(zhì)粒模板,然后用 Dpn I 去除原始的甲基化模板,新合成的DNA 通過互補形成帶切口的雙鏈質(zhì)粒,直接用于轉化感受態(tài)細菌。

三磷酸循環(huán)系列試劑盒 一管式點突變試劑盒
One-Stop Point mutation Kit


產(chǎn)品及特點
    基因的定點突變是重要的分子生物學技術,廣泛用于載體構建、基因改造、蛋白質(zhì)功能研
究等領域。但傳統(tǒng)的方法需要使用單鏈 DNA 模板,而得到單鏈 DNA 模板又需要先將基因克
隆到類似 M13 這種載體中,操作過程冗長。為了克服這些缺點,本公司將突變位點設計到一
對互補的引物中,用高保真擴增質(zhì)粒模板,然后用 Dpn I 去除原始的甲基化模板,新合成的
DNA 通過互補形成帶切口的雙鏈質(zhì)粒,直接用于轉化感受態(tài)細菌。本方法過程示意圖如下:


 

本產(chǎn)品具有下列特點:
    1. 直接使用質(zhì)粒 DNA 作為模板,免去了制備單鏈 DNA 的步驟。
    2. 基于高保真 PCR,對模板 DNA 序列沒特殊要求,可以用于突變?nèi)魏涡蛄小M瑫r對模板的需求量很少。
    3. 一管式,全部在一個優(yōu)化的緩沖體系中完成,非常簡單。
    4. 使用 Dpn I 去除未突變模板,突變效率高達 90%。
    5. 可用于制備點突變,缺失突變和插入突變。
    6. 本產(chǎn)品 A 型適用于 8 kb 一下,B 型適用于 8-15 kb。


規(guī)格及成分


成 份                 A 型10次包裝      B型10次包裝
高保真酶A型                  10 uL           無
高保真酶B型                  無                10 uL
5×高保真酶 Buffer A 型     100 uL                 無
5×高保真酶 Buffer B 型     無                     100 uL
dNTP(2.5 mM each)         50 uL                  50 uL
Dpn I 酶                      10 uL                  10 uL
超純水                        1 mL                   1 mL
使用手冊                      1 份                   1 份
運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存, 有效期一年。
自備試劑   質(zhì)粒 DNA、突變引物、細菌轉化試劑


使用方法
一、 引物設計及注意事項
    用于特定基因突變的引物必須用戶單獨設計,請參考如下一些基本原則進行設計。
    1. 共需設計兩條*互補的一對引物, 它們覆蓋要擴增的突變區(qū)位點, 突變位點好放在引物的中心??梢韵燃性O計一條,然后就可得互補的另一條引物。
    2. 引物的長度通常為 25-45 個堿基。引物中突變位點任何一側都必需滿足 Tm 大于45 的條件,Tm 計算方式為 Tm=4×(GC 堿基數(shù))+2×(AT 堿基數(shù))。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag 就達到此標準,它的突變位點 AAG 所放位置使左側 Tm=46;右側 Tm=48,均大于 45。
    3. 盡量把引物的 GC 含量控制在 40%-60%,結尾的 1-3 個堿基好是 G 或 C。
    4. 盡量使引物不要產(chǎn)生非常穩(wěn)定的二級結構和引物二聚體。
    5. 好使用經(jīng)過 PAGE 純化的引物或更高純度的引物。


二、待突變模板質(zhì)粒的選擇
    1. 必需使用從 dam+的大腸桿菌(這類菌中質(zhì)??梢员患谆?中抽提得到的質(zhì)粒用于基因定點突變,否則 Dpn I 不能把沒有酶切的質(zhì)粒 DNA 切除,產(chǎn)生大量的假陽性。必需使用從 dam+的大腸桿菌(這類菌中質(zhì)??梢员患谆?中抽提得到的質(zhì)粒用于基因定點突變,否則 Dpn I 不能把沒有酶切的質(zhì)粒 DNA 切除,產(chǎn)生大量的假陽性。
    常用的大部分大腸桿菌都是 dam+的,包括 DH5α、JM109 等。不能使用 JM110和 SCS110 以及其它 dcm-菌種。
    2. 待突變質(zhì)粒和目的基因的 GC 含量應該在 40-55%,沒有任何 GC 含量超過 70%、長度在 50bp 以上的區(qū)域。如果質(zhì)粒 GC 含量過高,請先把目的基因克隆到其它合適的載體上,再進行基因定點突變反應。如果目的基因 GC 含量過高,而突變位點不在高 GC 含量區(qū)域,可以先把該基因的不含高 GC 含量的一個區(qū)域克隆出來,進行定點突變,然后再把突變后的片斷克隆回原基因中。如果突變位點在高 GC 區(qū),則可以使用高 GC PCR 反應試劑。


三、 基因定點突變反應
1. 在一個塑料離心管中加入下列成分:

待突變模板質(zhì)粒          0.1-0.5 ug
5×高保真酶 Buffer      5 uL
引物一 (10-20 uM)       1 uL
引物二 (10-20 uM)       1 uL
dNTP Mix (2.5 mM each)  4 uL
補水到                  49 uL

2. 加入 1 uL 高保真 DNA 聚合酶,混勻,如果 PCR 儀沒有熱蓋則需要加少量石蠟油。
放入 PCR 儀器中按下面參數(shù)進行 PCR:

步驟 溫度時間 循環(huán)數(shù)
變性95℃ 1 分鐘 1 次
PCR(注:只 18 次循環(huán))95℃40 秒18 次
PCR(注:只 18 次循環(huán))60℃1 分鐘18 次
PCR(注:只 18 次循環(huán))68℃ 1 分鐘/Kb18 次
延伸72℃ 10 分鐘1 次
保存4℃ 長時間保持 

 

四、Dpn I 消化:
    PCR 反應后,直接在 PCR 反應體系中加入 1uL Dpn I 內(nèi)切酶 (該酶在甘油保存液中會下沉到管底,故用前需要充分混勻) 。DpnI 可以酶切雙鏈都被甲基化的模板質(zhì)粒,也能降解一條鏈被甲基化的雙鏈質(zhì)粒?;靹蚝?37℃孵育 2 小時后樣品可以直接用于轉化,或者-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>


五. 轉化、挑克隆鑒定:
    每 100 微升感受態(tài)細菌 (轉化效率必須在 10 7 /ug以上) 中可以加入 5-10 微升經(jīng)過DpnI消化后的突變產(chǎn)物,按照所使用的感受態(tài)細菌的操作方法進行操作。如果PCR使用了石蠟油,在轉化時千萬別把它帶入轉化反應,否則會嚴重影響轉化效率。在涂板前通過離心濃縮的辦法,把所有被轉化后的細菌全部涂布到含有適當抗生素的平板上培養(yǎng)。通常會得到 50 個以下的克隆,可按常規(guī)方法制備質(zhì)粒并測序。


六、常見問題:
     1. 轉化后沒有克隆或克隆數(shù)極少:(1) 感受態(tài)細菌效率不夠高,請檢測一下感受態(tài)細胞的效率,確保轉化效率在 10 7 /ug。(2) 把Dpn I消化后的產(chǎn)物用常規(guī)的乙醇沉淀濃縮,這樣就可以把所有的產(chǎn)物全部用于轉化。(3) 優(yōu)化基因定點突變中的PCR參數(shù)??梢园殉醯?95℃變性時間延長為 2 分鐘,循環(huán)中 95℃變性的時間延長 1 分鐘,把循環(huán)中的 68℃的延伸時間改為 1.5 分鐘/kb 2 分鐘/kb,退火可以改為 60-55℃或 65-55℃等的touch down,退火時間也可以適當延長。(4) 引物設計有問題。通過突變反應中的PCR沒有很好地擴增出預期的突變質(zhì)粒。
     2. 有克隆, 但沒有或很難檢測到預期的突變克?。?(1) 使用的待突變的模板質(zhì)粒量過多,導致 Dpn I 消化時不*,可減少質(zhì)粒用量。
     3. 有突變克隆,但突變位點不是預期的位點:(1) 引物設計不佳,退火溫度過低,導致引物退火到錯誤的地方。(2) 引物質(zhì)量較差,沒有經(jīng)過 PAGE 純化。這樣引物中通常會含有比設計的引物要短的特異性較差的引物,容易導致非預期的突變。

 

三磷酸循環(huán)系列試劑盒 一管式點突變試劑盒訂購說明:

1、絕大部分產(chǎn)品備有現(xiàn)貨,一般情況下都能訂貨當日發(fā)貨。 
2、部分非常用產(chǎn)品,需提前1-2日預訂,海外期貨則需要提前3-6周預訂。 
3、部分產(chǎn)品價格會因貨期、批次等因素發(fā)生變化,若有變動以訂貨當日新價格為準。 
4、每日訂單截止時間為16點整,部分城市可到17點整,因超過截止時間造成當日不能發(fā)貨的將于次日安排發(fā)貨。
5、請辦理完貨款后,將收據(jù)、底單等連同收貨人的地址、姓名、等以傳真、、短信、等形式通知我們。


運輸說明:

1、極低溫產(chǎn)品:極低溫產(chǎn)品運輸過程中加裝干冰運輸。用干冰把產(chǎn)品包裹起來,再用泡沫盒密封,膠帶層層粘住泡沫盒,放入索萊寶的箱子,然后交付給合作快遞,安全快速高效放心的送客戶的手中,保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一,為您的實驗保駕護航。
2、低溫產(chǎn)品:低溫產(chǎn)品運輸過程中加裝索萊寶冰袋運輸。事先用冰袋把產(chǎn)品包裹起來,再使用泡沫盒密封,用膠帶嚴實密封泡沫盒,再放入索萊寶的箱子(保溫效果少可以持續(xù)一周),然后交付給合作快遞,安全快速高效放心的送客戶的手中,保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一,為您的實驗保駕護航。
3、常溫產(chǎn)品:常溫產(chǎn)品運輸過程中無需加冰或者特殊包裝。產(chǎn)品由公司庫房人員快速配貨,準確快速高效的快遞保證產(chǎn)品快速送達您的手中。

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