甲基檸檬酸合酶（MCS）活性檢測(cè)試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號(hào)：BC5860

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑四：臨用前加入1.5mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

2、 試劑五：試劑放于棕色瓶?jī)?nèi)玻璃瓶中，臨用前加入3mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說明：

甲基檸檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，與檸檬酸合酶（CS）共同參與三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)。

MCS 催化丙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生甲基檸檬酰輔*A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生甲基檸檬酸；該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在412nm處有特征吸收峰，據(jù)此可以計(jì)算MCS活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、1mL玻璃比色皿、天平、低溫離心機(jī)、水浴鍋、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）和10μL試劑一，進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（10⁶個(gè)）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬(wàn)細(xì)菌/細(xì)胞加入1mL提取液和10μL試劑一），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間5min）；然后12000 g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱15min。

3、 操作表：在1mL玻璃比色皿或1.5mL EP管中分別加入（適用于測(cè)定動(dòng)物組織樣本）

4、 操作表：在1mL玻璃比色皿或1.5mL EP管中分別加入（適用于測(cè)定微生物和植物組織樣本）

注：在1.5mL EP管中進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，可參考以下步驟：先將比色皿置于分光光度計(jì)中，然后將反應(yīng)液混勻后迅速加入1mL玻璃比色皿中，記錄412nm下10s時(shí)的初始吸光度A1對(duì)照、A1測(cè)定，之后迅速將反應(yīng)液吸取到1.5mL EP管中，置于37℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)30min，迅速取出EP管并擦干，412nm下記錄30min10s時(shí)的吸光度A2對(duì)照、A2測(cè)定。

三、甲基檸檬酸合酶（MCS）計(jì)算公式

1. 動(dòng)物組織樣本：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（Cpr×V樣）÷T=420.17×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（W÷V提取×V樣）÷T=424.37×ΔA÷W

ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光徑，1cm；V反：反應(yīng)體系體積，1mL；V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.035mL；V提?。杭尤胩崛∫杭霸噭┮坏捏w積，1.01mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

2. 微生物和植物組織樣本：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（Cpr×V樣）÷T=12.25×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（W÷V提取×V樣）÷T=12.38×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌/細(xì)胞計(jì)算：

酶活定義：每10⁶個(gè)細(xì)菌/細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（N÷V提取×V樣）÷T = 12.38×ΔA÷N

ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光徑，1cm；V反：反應(yīng)體系體積，1mL；V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.2mL；V提取：加入提取液及試劑一的體積，1.01mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，以10⁶計(jì)。

注意事項(xiàng)：

1. 測(cè)定過程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失活。

2. 最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3. 由于提取液含有蛋白成分（約1mg/mL），故測(cè)定蛋白濃度時(shí)需要同時(shí)測(cè)定提取液的蛋白濃度。

4. 當(dāng)樣本ΔA＜0.01時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)酶促反應(yīng)時(shí)間或增大樣本量后測(cè)定，注意同步修改計(jì)算公式。

5. 當(dāng)樣本ΔA>1或A>1.5時(shí)，可將樣本用提取液適當(dāng)稀釋后測(cè)定，注意同步修改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.0918g小鼠心臟加入1mL提取液和10μL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿，取上清用后按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得ΔA=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2對(duì)照-A1對(duì)照）=（0.930-0.339）-（0.333-0.294）=0.552，按樣本質(zhì)量計(jì)算MCS活性得：

MCS活性（U/g 質(zhì)量）= 424.37×ΔA÷W =2551.76U/g 質(zhì)量。

2、 取0.1186g霉菌加入1mL提取液和10μL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿，取上清后按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得ΔA=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2對(duì)照-A1對(duì)照）=（0.536-0.396）-（0.357-0.376）=0.159，按樣本質(zhì)量計(jì)算MCS活性得：

MCS活性（U/g 質(zhì)量）=12.38×ΔA÷W =16.60 U/g 質(zhì)量。

3、 取0.1013g竹葉加入1mL提取液和10μL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿，取上清后按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得ΔA=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2對(duì)照-A1對(duì)照）=（0.477-0.413）-（0.411-0.403）=0.056，按樣本質(zhì)量計(jì)算MCS活性得：

MCS活性（U/g 質(zhì)量）=12.38×ΔA÷W =6.844 U/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Maerker, C, et al. "Methylcitrate synthase from Aspergillus fumigatus. Propionyl-CoA affects polyketide synthesis, growth and morphology of conidia. " Febs Journal 272.14(2010):3615-3630.

[2] Watson, D., Lindel, D.L. & Fall, R. Pseudomonas aeruginosa contains an inducible methylcitrate synthase. Current Microbiology 8, 17–21 (1983).

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