Taq DNA Polymerase說明書

貨號(hào)：K0680

保存條件：-20℃保存。

組分說明

         Cat. No.                       K0680     K0680E      K0680F

         Kit Size                        500 U      6×500 U     5×2000 U

         Taq DNA Polymerase,  5 U/μl     100 μl     6×100 μl    5×400 μl

         10×Taq PCR Buffer with  Mg2+    2×1 ml      3×5 ml      8×5 ml

                 注意：本產(chǎn)品的10×Taq PCR Buffer中含有15 mM鎂離子。

產(chǎn)品簡介

　　Taq DNA  Polymerase是通過大腸桿菌表達(dá)純化的重組酶。其基因來源于Thermus

aquaticus polymerase。該蛋白分子量為94 kDa，具有5′→3′ DNA聚合酶活性和5′→3′外切核酸酶活性，無3′→5′外切核酸酶活性，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物3′端附有一個(gè)“A"堿基，因此可直接用于 T/A克隆。本產(chǎn)品具有延伸速度快、擴(kuò)增效率高的特點(diǎn)，主要適用于PCR法擴(kuò)增DNA片段、DNA序列測(cè)定等實(shí)驗(yàn)。

活性定義

　　用活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物，在74℃，30分鐘內(nèi)，將10 nmol脫氧

核苷酸摻入到酸性不溶物質(zhì)所需的酶量定義為1個(gè)活性單位（U）。

質(zhì)量控制

　經(jīng)過多次柱純化， SDS-PAGE檢測(cè)其純度大于99%；經(jīng)檢測(cè)無外源核酸酶活性；

PCR方法檢測(cè)無宿主殘余DNA；能有效地?cái)U(kuò)增人基因組中的單拷貝基因；室溫存放一

個(gè)月，無明顯活性改變。

                本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途

     使用方法

     以下舉例為常規(guī)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的

     片段大小不同進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)和優(yōu)化。

     1. PCR反應(yīng)體系

 試劑                       50 μl體系              終濃度

10×Taq PCR Buffer with Mg²⁺          5 μl             1×

dNTP Mix，2.5 mM each                    4 μl        200 μM each

Forward Primer，10 μM                    2 μl           0.4 μM

Reverse Primer，10 μM                    2 μl           0.4 μM

Template DNA                           <1 μg       <1 μg/reaction

Taq DNA Polymerase，5 U/μl              0.25 μl

RNase-Free Water                     up to 50 μl

        注意：1）引物濃度請(qǐng)以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

        2）鎂離子濃度請(qǐng)以終濃度1.5-3 mM作為設(shè)定范圍的參考。本產(chǎn)品的10×PCR Buffer中已經(jīng)含有15 mM鎂離子，可根據(jù)不同的引物對(duì)和模板來調(diào)節(jié)鎂離子濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

2. PCR反應(yīng)條件

步驟                    溫度                 時(shí)間

預(yù)變性                    94℃                2 min

變性                    94℃                30 s

退火                 55-65℃               30 s       25-35個(gè)循環(huán)

延伸                    72℃                30 s

終延伸                    72℃                2 min

注意：1）一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，無法得到理想的擴(kuò)增效率時(shí)，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。

2）延伸時(shí)間應(yīng)根據(jù)所擴(kuò)增片段大小設(shè)定，本產(chǎn)品Taq DNA Polymerase的擴(kuò)增效率為1 kb/30 s。

3）可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配機(jī)率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以在保證產(chǎn)物得率的前提下應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

3.結(jié)果檢測(cè)：反應(yīng)結(jié)束后取5  µl反應(yīng)產(chǎn)物，加入適量上樣緩沖液后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電

       泳檢測(cè)。

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