RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液的配制  

1. 配制培養(yǎng)基使用新制備的三蒸水。一般在試驗(yàn)前當(dāng)天或前一天制備為好。調(diào)節(jié)pH值的酸堿溶液也應(yīng)該使用這種水配制。

2. 制備培養(yǎng)基的器皿清洗要干凈，烤干后備用（濾器、濾膜、量筒、移液管及盛放培養(yǎng)基的小瓶等存放和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基液體的器具都應(yīng)進(jìn)行滅菌）。

3. 溶解培養(yǎng)基：將干粉培養(yǎng)基溶于總量1/3的水中，再用水洗包裝袋內(nèi)面兩次，倒入培養(yǎng)液中。振蕩或超聲助溶，一般不要加熱助溶。

4. 補(bǔ)加試劑：根據(jù)包裝袋說(shuō)明和試驗(yàn)需要加入NaHCO3（2.0g）、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等其他試劑。 

5. 加抗生素：一般抗生素終濃度為――青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml。市售青霉素為80萬(wàn)U／瓶，可溶于4ml體積，每一升培養(yǎng)液中加0.5ml即可。市售鏈霉素為100萬(wàn)U／瓶，可溶于5ml體積，每一升培養(yǎng)液中也加0.5ml即可。無(wú)鏈霉素的情況下，用慶大霉素代替，終濃度調(diào)為50～200U/ml。

6. 調(diào)pH值：加水到900ml（在需要加10％小牛血清的情況下），然后用5％ NaHCO3 調(diào)節(jié)pH到7.2。 

7. 過(guò)濾除菌：宜采用0.45um和0.22um濾膜各一張，上層為0.45um，下層為0.22um，以保證過(guò)濾效果。注意濾膜正面（光面）朝上。過(guò)濾后分裝于小瓶中（100或200ml）。

8. 加小牛血清：根據(jù)培養(yǎng)基配制的量將小牛血清分裝，冷凍保存（－20℃）。臨用前將加入小牛血清(10%~20%)。 

【注意事項(xiàng)】  每次配液時(shí)，需要的其他輔助性液體（Hanks，胰蛋白酶消化液，PBS，抗生素溶液等）也可以同時(shí)配制，分別過(guò)濾。  市售小牛血清使用前都應(yīng)該滅活（56℃，30min），以消除補(bǔ)體活性。動(dòng)物血清個(gè)體差異大，故而每一批血清都進(jìn)行嚴(yán)格檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)。血清應(yīng)該為淡黃色，透明，無(wú)溶血，無(wú)沉淀，滅活后顏色稍深。生化檢測(cè)總蛋白含量3.5~4.5g/100ml，球蛋白不高于2g／100ml。選定一個(gè)效果較好的批號(hào)后，可一次多購(gòu)該批號(hào)的血清，保證試驗(yàn)條件的穩(wěn)定。  由于市售小牛血清pH未知，但大多偏酸。試驗(yàn)中加入小牛血清后，培養(yǎng)基的pH可能還會(huì)變化，故亦可先加入小牛血清后調(diào)pH值。但此種方法過(guò)濾較困難，只適于正壓過(guò)濾。  培養(yǎng)液配好后，應(yīng)先抽取少許放入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37℃溫箱內(nèi)置24～48hr，以檢測(cè)培養(yǎng)液是否有污染。  每次配液量以?xún)芍茏笥覟橐耍淮闻湟翰灰?，防止?fàn)I養(yǎng)成分（主要為谷氨酰胺）損失，造成實(shí)驗(yàn)繁瑣或者污染。 

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM的配制（初學(xué)）  2010.07.02  細(xì)胞培養(yǎng)基是由合成培養(yǎng)和小牛血清配制而成。合成培養(yǎng)基有商品出售，它是根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的需要按一定配方制成的粉狀物質(zhì)。其主要成分是氨基酸、纖維素、碳水化合物、無(wú)機(jī)離子和其它輔助物質(zhì)。它的酸堿度和滲透壓與活體內(nèi)細(xì)胞外液相似。小牛血清含有一定的營(yíng)養(yǎng)成分，更重要的是它含有細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的生長(zhǎng)因子、激素、貼附因子等，這是合成培養(yǎng)基無(wú)法替代的。此外它還能中和有毒物質(zhì)的毒性。故一般體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)要加入一定量的小牛血清（１0%）。

【儀器、材料和試劑】

1．儀器：蠕動(dòng)泵1套，濾器，高壓蒸汽滅菌鍋，磁力攪拌器，pH計(jì)。

2．材料：3000mL錐形瓶，250mL或500mL培養(yǎng)液瓶，0.22mm的微孔濾膜。

3．試劑：雙蒸水，小牛血清，合成培養(yǎng)基（DMEM），NaHCO3。

【操作步驟】 

1．過(guò)濾器的準(zhǔn)備和安裝

（1）清洗好過(guò)濾器，干燥 

（2）將一張0.22mm的微孔濾膜在DDW中浸泡后放入濾器，注意不要有氣泡。

（3）用布或報(bào)紙包裝好，121℃ 30min進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理。

（4）在超凈臺(tái)內(nèi)安裝好過(guò)濾裝置，準(zhǔn)備過(guò)濾。

2．合成培養(yǎng)基的配制 DMEM    13.5g NaHCO3     3.7g       HEPES   2.38g DDW溶解  10M的NaOH調(diào)pH為7.5   定容1L 

(1)將干粉型培養(yǎng)基DMED溶于300ml的三蒸水中，再用300ml水沖洗包裝內(nèi)面兩次，倒入培養(yǎng)液中，以保證所有干粉都溶解成培養(yǎng)液。 

(2)加入NaHCO3 3.7g  HEPES   2.38g。磁力攪拌器攪拌。*溶解即可，不易在空氣中攪拌過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，大量的CO2融入會(huì)影響培養(yǎng)基的pH

（3）正常情況下用10M的NaOH調(diào)pH為7.5。

（4）過(guò)濾除菌。于超凈臺(tái)中濾器過(guò)濾。 

（5）濾前、濾后分別取10ml的培養(yǎng)基于15ml的離心管中，置37℃ 24h，檢測(cè)是否無(wú)菌。 

（6）檢測(cè)無(wú)污染后，2℃－8℃下避光保存。  

（7）使用時(shí)加入加抗生素：zui終濃度青霉素為100U/ml，鏈霉素100μg/ml。一般市售青霉素為80萬(wàn)U/瓶，將其溶解在4ml體積內(nèi)，每1000ml培養(yǎng)液中加0.5ml，即成zui終濃度為100U/ml。市售鏈霉素為100萬(wàn)U/瓶，將其溶解5ml體積內(nèi)，也是每1000ml加0.5ml，使其zui終濃度為100μg/ml。

（8）加入小牛血清  市場(chǎng)上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應(yīng)做熱滅活處理，即通過(guò)加熱的方法破壞補(bǔ)體。  將血清放入56℃水浴中30min，其間要不時(shí)輕輕晃動(dòng)，使受熱均勻，防止沉淀析出。根據(jù)培養(yǎng)基量加入小牛血清，使其終濃度為10%。  每次配液量以使用兩周左右的量為宜。一次配液不要太多，一是營(yíng)養(yǎng)成分有損失，二是容易污染。